胆总管囊肿是小儿胆道常见的疾病,有时延至成人发病。自从Irwin和Morison报道了先天性胆总管囊肿胆道癌变以后,人们才逐渐认识到胆总管囊肿与胆道癌的关系：其恶性肿瘤的发生率为3.2%-39.2%,并且随着年龄的增大而增加。近十几年来,相继有学者报告长期随访经切除囊肿并行肝管空肠吻合的胆总管囊肿患者仍有发生癌变的情况。因此,胆总管囊肿的癌变成为研究的热点。关于其癌变机制,学者们指出胆总管囊肿的癌变是多阶段的过程,胰液、胆汁混合反流是危险始动因素。目前有关研究主要集中于胆道上皮细胞增殖动力学改变,癌基因和抑癌基因突变等。尽管如此,胆总管囊肿癌变的分子生物学机制事实上仍未完全阐明。近期有学者研究报道了胆总管囊肿患者胆道粘膜上皮细胞内环氧化酶-2表达增加,指出环氧化酶-2可能参与其癌变过程。环氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。目前发现细胞中至少有三种环氧化酶的编码基因，即环氧化酶-1,环氧化酶-2和环氧化酶-3。环氧化酶-1属于结构型酶,在大多数组织中微量恒定表达,其催化产物参与维持机体正常生理功能；环氧化酶-2属于诱导型酶,正常生理情况下多数组织中难以测到。目前已知诱导环氧化酶-2表达的因素可存在细胞内外,如各种细胞因子,炎症因子,内毒素,致癌剂,癌基因和抑癌基因等。在Barrett食管(BE)中,Shirvani等用胆盐刺激BE组织发现环氧化酶-2表达增高。因此推测胆总管囊肿患者存在诱导环氧化酶-2表达的可能因素。一般认为,激活的环氧化酶-2具有两种酶活性：一是环氧化酶的作用,将花生四烯酸转化为PGG2；二是过氧化酶的活性将PGG2转化为PGH2,其功能主要是启动、促进炎症反应。近期研究表明环氧化酶-2还与肿瘤尤其是消化道肿瘤,如食管癌、胃癌、结肠癌等的发生、发展有密切关系。它不仅影响细胞周期和细胞凋亡(通过促进抑制凋亡基因的表达,如bcl-2而发挥作用),而且还影响肿瘤血管的形成(如促进VEGF表达),肿瘤细胞的浸润转移(通过产生过量的PGs(如PGE2)使机体免疫监视功能受抑制)等。因此环氧化酶-2有可能作为一种有效的预防和治疗肿瘤的靶分子,即环氧化酶-2抑制剂有可能预防肿瘤的发生、发展,这一点已经在食管癌、结肠直肠癌等中得到证实。本研究目的在于：探讨环氧化酶-2在胆总管囊肿癌变中的作用机理,从而提出预防胆总管囊肿癌的可能的方法和策略。第一部分不完全梗阻性黄疸大鼠胆总管上皮细胞中环氧化酶-2表达研究及Bcl-2和Fas对胆管上皮细胞凋亡的调节作用目的了解环氧化酶-2 (Cox-2)、Bcl-2、Fas蛋白在不完全梗阻性黄疸大鼠胆总管上皮细胞中的表达以探讨Cox-2与胆管上皮组织学改变的关系；Bcl-2、Fas蛋白与胆总管上皮细胞凋亡的关系。方法60只SD大鼠,雌雄不拘,随机分为不完全梗阻性黄疸组40只(A组)和实验对照组20只(B组)。A组不完全结扎大鼠胆总管建立动物模型,B组仅打开腹腔游离胆总管末端即可。两组分别于术后3、7、14、2ld处死,检测血清胆红素(TBIL)的变化,观察胆总管病理组织学的改变,TUNEL法观察胆总管上皮细胞凋亡,免疫组化法检测大鼠胆总管上皮中Cox-2、Bcl-2、Fas蛋白的表达。结果A组随着梗阻性黄疸时间的延长,血清胆红素逐渐增高,胆总管上皮细胞凋亡指数逐渐增多；B组变化不明显。A组与B组比较有显著性差异(P<0.05)。A组在结扎后7d时胆总管明显扩张,有较多的炎症细胞浸润,21d时发现胆总管进一步扩张,管壁明显增厚,出现上皮组织及纤维组织增生,B组无明显变化。A组Cox-2蛋白在结扎后3d,7d均为弱阳性表达,14d,21d均为阳性表达；B组Cox-2蛋白均为阴性表达。A组Bcl-2、Fas蛋白在结扎后3d均为弱阳性表达,7d,14d均为阳性表达,21d均为强阳性表达；B组均为阴性表达。结论Cox-2蛋白和Bcl-2蛋白可能与不完全梗阻性黄疸时上皮细胞增生有关；不完全梗阻性黄疸的大鼠的胆总管上皮细胞增生,管壁增厚,最终导致癌变可能,其机制可能是COX-2通过Bcl-2途径产生致癌作用。细胞凋亡是机体维持自身稳定的一个重要机制。Fas蛋白和Bcl-2蛋白对不完全梗阻性黄疸大鼠胆总管上皮细胞凋亡有调节作用。第二部分小鼠肝外胆管上皮细胞的分离、原代培养及鉴定方法研究目的建立一种重复性好、可靠的小鼠肝外胆管上皮细胞(MEBECs)体外分离、原代培养的方法。方法Ⅰ型鼠尾胶原包被塑料培养瓶。把10只腹腔注射了7次新生牛血清(NBS)的BALB/c小鼠处死,分离并取出肝外胆管组织,将其剪至1mm3大小后,先采用2.5g/L胰酶和2万U/L DNaseⅠ,再用20万U/LⅣ型胶原酶消化、分离小鼠肝外胆管组织为细小、均匀的细胞团进行接种,接种的细胞团用含100ml/L胎牛血清(FBS)、10ug/L表皮生长因子(EGF) DMEM/HamsF12(1：1)培养基进行原代培养。倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法测细胞生长曲线,分别用细胞角蛋白19抗体(anti-CK19)免疫细胞化学染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果细胞在接种24-48h后贴壁增殖,形成大小不等的“细胞岛”。在接种1周内生长旺盛,第3、4天达到峰值,呈典型的鹅卵石样表观。anti-CK19免疫细胞化学染色,细胞质呈棕黄色着色,细胞核蓝色,呈阳性表达；透射电镜观察,MEBECs表面可见短而多的微绒毛,胞内线粒体、粗面内质网丰富,可见少量脂滴。结论此培养方法是一种可靠的MEBECs的分离纯化培养技术,为体外研究肝外胆管上皮病变提供实验平台。第三部分环氧化酶-2在甘氨鹅脱氧胆酸钠致胆管上皮细胞癌变中的机理研究目的观察胆盐对体外培养的小鼠肝外胆管上皮细胞(murine extrahepatic bile duct epithelial cells, MEBECs)增殖的影响,以探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在胆盐致MEBECs癌变过程中的作用机理,从而提出预防MEBECs癌变可能的方法和策略。方法不同浓度(0,50,100,200μmol/L)的甘氨鹅脱氧胆酸盐(GCDC),牛磺胆酸盐(TC),牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDC),牛磺脱氧胆酸盐(TDC),牛熊脱氧胆酸盐(TUDC)加到培养基中。200μmol/L GCDC加入细胞培养基中,同时给予不同浓度尼美舒利(0,50,100,200μmol/L),采用MTT法测定细胞增殖；Real-time PCR法检测环氧化酶-2 (COX-2) mRNA的表达；Western blot法检测MEBECs中COX-2蛋白表达水平的变化；ELISA法检测前列腺素E2(PGE2)含量。结果各种浓度(50,100,200μmol/L)的GCDC具有刺激MEBECs增殖的作用,诱导MEBECs表达COX-2 mRNA,合成PGE2。而其它四种胆盐在各种浓度(50,100,200μmol/L)时对MEBECs无明显影响。各种浓度(50,100,200μmol/L)的尼美舒利可抑制GCDC诱导的MEBECs增殖。随着尼美舒利浓度的增加,MEBECs表达COX-2 mRNA的水平降低(P<0.05),合成PGE2的量也减少(P<0.05)。上述作用均呈浓度依赖性。结论GCDC对MEBECs增殖有促进作用,提示可能潜在致癌活性,尼美舒利可抑制GCDC诱导的MEBECs增殖,抑制COX-2 mRNA和蛋白表达及PGE2合成,这可能是尼美舒利抑制MEBECs增殖的机制之一,提示尼美舒利可能具有预防胆管上皮癌变的作用。