论文部分内容阅读
矮牵牛(Petunia×hybrida)为茄科多年生草本植物,是重要的园林景观花卉,市场需求量大,但忌水湿,因此提高花卉抗逆性是当前矮牵牛育种的重要目标之一。本文以矮牵牛乙烯响应因子Ph ERF2 6个转基因株系及其野生型为材料,涝渍胁迫处理后,对其耐涝性进行评价,并测定相关生理生化指标。选择耐涝性差异显著的两个株系,进行RNA-Seq转录组测序研究,共筛选出6788个差异表达基因,进行GO分类、KEGG富集分析,获得Ph ERF2调控的下游候选基因:Sn RK2、ABF、EBF1/2、ERF1/2、ADH1、LDH、PDC4、CAT3、SODA、ACO1、ACS3等,为矮牵牛耐涝分子育种奠定基础。主要研究结果如下:1.建立矮牵牛耐涝评价体系。采用盆栽淹水法,将植物在淹水过程中的表型变化作为评价指标,依据等级得分标准,建立耐涝评价体系,对矮牵牛Ph ERF2 6个转基因株系及其野生型的耐涝性进行综合鉴定,初步确定了Ph ERF2过表达株系耐涝。2.对7个矮牵牛株系的根系通气组织、根系活力、叶绿素含量、MDA含量和可溶性蛋白含量进行研究。整个淹水处理期间,所有植株的根系活力呈持续下降的趋势,且RNAi沉默株系的下降幅度大于Ph ERF2过表达株系;淹水处理48h后,Ph ERF2过表达株系的叶绿素和可溶性蛋白含量均显著高于RNAi沉默株系和野生型;除12h外,RNAi沉默株系和野生型的MDA含量均显著高于Ph ERF2过表达株系,表明野生型和RNAi沉默株系受氧化损伤较严重。淹水处理24h时,Ph ERF2过表达株系I根中DNA浓缩,形成月形核,具有PCD典型特征,表明Ph ERF2可通过促进根系通气组织的形成避免低氧胁迫,提高植物耐涝性。3.对7个矮牵牛株系的光合生理指标进行测定。淹水胁迫下,Ph ERF2过表达株系的Pn、Gs、Tr、Ci与对照相比均下降,表明Ph ERF2过表达株系的净光合速率下降主要受气孔限制因素影响;RNAi沉默株系的Pn、Gs、Tr总体呈下降趋势,而Ci在处理3h时下降,随后逐渐升高,表明RNAi沉默株系的净光合速率主要受非气孔限制因素影响,受涝害损伤较严重。4.对7个矮牵牛株系的叶片抗氧化酶活性、根系无氧呼吸酶活性进行测定。整个试验期间,Ph ERF2过表达株系的抗氧化酶活性总体高于RNAi沉默株系和野生型,表明Ph ERF2可能通过增强植物清除活性氧的能力,提高植物耐涝性;而RNAi沉默株系和野生型的ADH、LDH活性整体上显著高于Ph ERF2过表达株系,表明Ph ERF2可能通过调节无氧呼吸途径,减轻乳酸、乙醇等代谢产物对细胞的毒害作用,提高植物的耐涝性。5.取耐涝性差异显著的Ph ERF2过表达株系I、Ph ERF2-RNAi沉默株系4B为材料,以野生型WT为对照,在涝渍处理0、3小时取根系,用于RNA-Seq分析。结果显示:共获得115.49G的Clean Data,各样本的有效数据量分布在6.04～6.66G,Q30碱基分布在81.34～91.55%,平均GC含量为43.99%。通过将reads比对到参考基因组上,得到各个样本的基因组比对情况,比对率为92.16～94.49%。基于比对结果,进行蛋白编码基因表达量分析。根据蛋白编码基因在不同样品中的表达量,进行差异筛选,共设有9个差异分组,当筛选条件设定为p<0.05,FC>2时,其检测到的差异蛋白编码基因数量分别为:2589、2119、3728、1000、3793、1881、1500、5288、3187。6.对比较组3h-4B-VS-3h-WT和比较组3h-I-VS-3h-WT中的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO分类结果显示,两个比较组中的DEGs均主要富集在生物过程中的代谢过程、细胞过程、单一生物过程功能组;细胞组分中的细胞、细胞部分、细胞膜功能组;分子功能中的蛋白结合、酶催化活性、转运活性功能组。KEGG分析结果显示,两个比较组中的DEGs均在植物激素信号转导代谢通路Ko04075中显著富集。7.Ph ERF2调控的下游候选基因涉及四条生化代谢通路:(1)植物激素信号转导代谢通路:Sn RK2、ABF、EBF1/2、ERF1/2;(2)无氧呼吸途径:ADH1、LDH、PDC4等;(3)抗氧化酶系统:CAT3、SODA等;(4)乙烯及其信号途径:ACO1、ACS3等。因此推测Ph ERF2可以通过在转录水平上激活或抑制上述候选基因,调控脱落酸信号转导通路、乙烯代谢通路、糖酵解/糖异生代谢通路和叉头转录因子FOXO信号途径,从而促进植物光合作用、延缓植物衰老、减轻无氧呼吸产物对细胞的毒害作用并增强植物抗氧化能力,进而提高了植物的耐涝性。后续还需着重筛选1-2个重要差异表达候选基因进行功能验证,完成基因间共表达网络构建,解析Ph ERF2对矮牵牛响应涝渍胁迫的分子机理。