研究背景和意义：由于体型小、便于操作,而且解剖、生理生化特性与人特别相近的特点,小型猪已逐渐成为生物医药研究领域重要的实验动物,应用数量逐年大幅递增。西藏小型猪是世界上体型较小的小型猪之一,来源于青藏高原、海拔2500-4300米的农区和办农牧区,是唯一能适应高海拔气候和以放牧为主的猪种,封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。南方医科大学实验动物中心于2004年将西藏小型猪从西藏引进至广州进行实验动物化研究,目前已完成风土驯化及实验动物化研究,并开展了相关动物模型、药物试验及转基因克隆等研究。从免疫学、遗传学等研究发现,该品系具有其独特的免疫相关指标和遗传特征,加上其独特的外形,是一种优良的实验用小型猪品系。小型猪的皮肤系统与人的有较大的相似性,故被认为是皮肤相关研究的理想模型猪和人的皮肤均由表皮、真皮、皮下组织三层组成；猪的皮肤在解剖结构、形态、生理生化特性与药理学等方面与人的非常相似,包括皮肤厚薄(如小型猪皮肤70-140微米厚,人皮肤50-120微米厚,而大鼠皮肤10-20微米厚)、皮肤形态学和增生动力学、皮肤修复再生性、烧伤皮肤的体液和代谢变化规律等。因此,猪被认为是皮肤和整形外科手术的标准模型,也是进行皮肤移植、化妆品安全性评价、紫外线照射、皮肤致癌、烧伤、冻伤、皮肤的老化及抗老化等研究的理想实验材料。但是,猪皮肤表面被毛,在对小型猪进行皮肤实验或外科手术之前,总是免不了繁琐的剃毛程序。常见的无毛小型实验动物有裸鼠、豫医无毛小鼠和无毛豚鼠,其中无毛豚鼠已被广泛应用于皮肤相关研究(如生发剂疗效、皮肤过敏反应、植皮治疗、紫外线辐射反应等)。目前,世界上仅有的一种无毛猪品系为尤卡坦(Yucatan)小型猪,也叫墨西哥无毛猪,广泛应用于皮肤研究。目前,我国已培育了许多小型猪品系：包括五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪、版纳微型猪和西藏小型猪等,尚未培育出无毛小型猪品系,而生物医学研究急盼基于中国培育的小型猪品系创制无毛小型猪新品系。创制无毛小型猪品系,将免除相关实验过程中繁杂的脱毛程序和由此造成的皮肤损伤,无毛小型猪可广泛用于皮肤移植、化妆品安全性评价、紫外线照射、皮肤致癌、烧伤、冻伤、皮肤老化及抗老化等实验,同时也为脱发研究提供了理想的大动物模型,对我国的生物医药研究有着重大意义。通常可通过如下方法获得一种新的实验动物品系(如白花或无毛)：从自然出生的动物中筛选出具有突变表型的个体,然后进行近交繁育,最终获得具有此表型的新品系,前面提及的豫医无毛小鼠和无毛豚鼠都是通过这种方法培育的。但是对于大型实验动物来讲,通过如上方法获得具有突变表型的个体,并进而培育成新的品系,是非常困难的和不太现实的。已有研究发现,皮肤特异性过表达小鼠DKK1转基因(其表达受人皮肤特异性的K14启动子调控)的转基因小鼠皮肤无毛(即获得了无毛小鼠),这是由于皮肤特异性过表达DKK1转基因导致小鼠毛发发育受阻,而该转基因小鼠的其它方面情况正常。大量研究表明,在人和高等动物(如小鼠和猪等)的发育过程中,不同物种间的同一基因(如DKK1)的编码序列高度同源,这决定其功能在不同物种间往往是保守的。猪DKK1基因的编码序列与人和小鼠的高度同源,这些预示DKK1基因的功能在人、猪和小鼠等间亦是保守的(即功能相同),这提示在转基因猪的皮肤特异性过表达猪DKK1转基因,亦有可能导致该DKK1转基因猪毛发发育受阻而变得无毛,从而获得无毛猪。此外,采用慢病毒载体法制备了皮肤特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)基因(GFP表达受人皮肤特异性的K14启动子调控)的转基因猪,证实人K14启动子在猪上能正常工作,且GFP基因的表达被限定在猪皮肤,而其它组织无GFP表达,这预示人K14启动子能控制其所调控的转基因在猪皮肤组织特异性表达。目前,制备转基因猪的方法主要有两种：体细胞核移植法和慢病毒载体法,其中后一种方法制备转基因猪受制于受精卵采集和数量的限制,不能被普遍应用。基于此,本课题将采用体细胞核移植法制备转基因克隆猪。综上,本课题拟借助转基因体细胞核移植法,建立猪皮肤特异性过表达猪DKK1转基因(猪DKK1转基因的表达受人K14启动子调控)的转基因克隆小型猪(即制作DKK1转基因体细胞克隆西藏小型猪),以实现在转基因小型猪皮肤特异性过表达DKK1转基因,进而导致转基因小型猪毛发发育受阻而变得无毛,从而实现创制无毛小型猪新品系的目标。本课题拟首先基于本中心培育的西藏小型猪创制无毛小型猪,如获成功将进一步基于中国培育的其它小型猪品系采用同样的方法创制无毛小型猪新品系,以便更好满足多方面的使用需求。方法：1.构建携带西藏小型猪DKK1基因的慢病毒载体pERKDZG首先从西藏小型猪肝脏组织提取RNA,逆转录为cDNA,设计引物并PCR扩增西藏小型猪DKK1(简写为pDKK1)基因编码区。然后通过酶切、in-fusion克隆的方法,进行如下3步DNA克隆：①将pDKK1基因插入载体pK14-DKK1,替换其中的鼠DKK1片段,以O获得载体pK14-pDKK1;②从载体pCDH-CMV-MCS-EF1a-RFP中扩增EF1a-RFP片段,插入至慢病毒载体pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen,获得载体pEREZG;③从载体、pKl4-pDKK1中扩增K14-pDKK1片段,插入载体pEREZG,获得最终慢病毒载体pERKDZG。2.借助慢病毒将目的转基因导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs)利用慢病毒载体pERKDZG包装病毒,然后用携带目的转基因ERKDZG的慢病毒感染PEFs,借助RFP和GFP监测外源转基因导入与表达情况。对病毒感染后的PEFs进行扩大培养,然后借助流式细胞仪分选RFP阳性的细胞,最终获得纯的可用于体细胞核移植的经遗传修饰的PEFs,命名为PEF-DKK1。从生产慢病毒时转染了pERKDZG的293T细胞提取总RNA,进行逆转录,RT-PCR检测细胞中DKK1基因表达。3.K14启动子和转基因载体pERKDZG的体外功能验证将pERKDZG分别转染皮肤细胞[即西藏小型猪皮肤成纤维细胞(PDFs)、小鼠皮肤黑色素瘤细胞系B-16]和非皮肤细胞[即PEFs、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人鼻咽癌细胞系HNE1细胞、293T细胞],然后在倒置荧光显微镜下观察RFP和GFP在以上六种细胞中的表达情况,以验证K14启动子组织特异性和转基因载体pERKDZG的功能性。4.通过体细胞核移植技术制作DKK1转基因体细胞克隆西藏小型猪从屠宰场收集猪卵巢,实验室收集卵母细胞,并进行成熟培养。成熟培养40小时后,透明质酸酶处理,脱去卵丘,显微操作仪下进行卵母细胞的去核,然后将PEF-DKK1细胞注射入去核卵母细胞透明带下,然后电融合激活,使重构卵开始发育,体外短暂培养重构胚胎,将2-4细胞期的早期重构胚胎移植入发情母猪的输卵管,依赖代孕母猪生产转基因克隆西藏小型猪,克隆猪出生后根据表型再确认是否获得无毛猪。结果：1.构建携带西藏小型猪DKK1基因的慢病毒载体pERKDZG成功克隆西藏小型猪DKK1基因,并成功构建慢病毒载体pEREZG,载体经酶切鉴定和测序,完全符合预期。2.将目的基因导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞携带目的转基因ERKDZG的慢病毒感染PEFs后,发现仅有少量细胞发红色荧光,预示感染效率很低；然后对感染后的细胞进行扩大培养,流式细胞仪分选RFP阳性的细胞,最终获得纯的可用于体细胞核移植的经遗传修饰的PEFs,命名为PEF-DKK1。RT-PCR检测显示,DKK1转基因在293T细胞中能够正常过表达。3.K14启动子和转基因载体pERKDZG的体外功能验证pERKDZG转染六种细胞后,发现成功转染pERKDZG的四种细胞中,皮肤细胞(B16)和非皮肤细胞(293T、PEFs和HNE1均有GFP和RFP表达；与RFP相对表达强度相比,皮肤细胞B16和293T上GFP表达相对较强,而其它细胞(PEFs和HNE1)上GFP表达相对较弱。总之,K14启动子和转基因载体pERKDZG的具有功能,可以进行下一步实验。4.通过体细胞核移植技术制作DKKl转基因体细胞克隆西藏小型猪成功进行卵母细胞的采集,体外成熟培养,核移植操作。重构胚胎体外培养7天,发育正常,囊胚率20%左右,重构胚全部表达RFP,部分表达GFP,预示目的基因已经转入重构胚并正常表达。共移植受体猪5头,其中两头怀孕足月产克隆猪8头,经PCR鉴定,其中3头为DKK1转基因克隆猪。DKK1转基因克隆猪表达RFP和GFP。结论：1.成功构建携带猪DKK1基因的慢病毒载体pERKDZG,并利用该慢病毒将西藏小型猪DKK1基因导入PEFs,进而流式分选获得纯的经遗传修饰的PEFs(命名为PEF-DKKl),其作为核供体细胞。2.体外功能验证,K14启动子和转基因载体pERKDZG具有功能,可以进行后续实验。3.通过体细胞核移植技术,成功获得3头携带西藏小型猪DKK1转基因的克隆猪,DKK1转基因克隆猪可正常表达RFP和GFP。本研究的创新之处：本研究利用我国独特的小型猪品系—西藏小型猪,将体细胞基因修饰和克隆技术相结合,培育具有我国自主知识产权的DKK1转基因体细胞克隆西藏小型猪,期望获得无毛西藏小型猪品系,以为皮肤移植、化妆品安全评价、紫外线照射、皮肤致癌、烧伤、冻伤、皮肤老化及抗老化等研究提供标准化的无毛实验小型猪。此外,也为研究人类毛发再生机制和脱发的基因治疗提供大型实验动物模型。