【摘 要】
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[目 的]ANP32E作为酸性核酸蛋白家族成员之一,参与细胞凋亡和细胞细胞周期调节等生物进程,本文通过整合公共数据库中宫颈癌数据,从分子、细胞、组织及动物等层面深入探究该基因在宫颈癌中发挥的作用,进一步揭示和丰富宫颈癌发生的分子机制,对宫颈癌的诊断和治疗提供重要的理论意义和临床应用价值。[方 法]从TCGA和GEO数据库中下载包含宫颈癌组织及对照的基因表达数据,通过GEPIA2在线数据库查看ANP
【基金项目】
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云南省教育厅基金（2021J0226）； 昆明医科大学研究生创新基金项目（硕士）,课题名称:ANP32E在宫颈癌发生发展中的作用及机制研究,课题编号:2020S014；
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[目 的]ANP32E作为酸性核酸蛋白家族成员之一,参与细胞凋亡和细胞细胞周期调节等生物进程,本文通过整合公共数据库中宫颈癌数据,从分子、细胞、组织及动物等层面深入探究该基因在宫颈癌中发挥的作用,进一步揭示和丰富宫颈癌发生的分子机制,对宫颈癌的诊断和治疗提供重要的理论意义和临床应用价值。[方 法]从TCGA和GEO数据库中下载包含宫颈癌组织及对照的基因表达数据,通过GEPIA2在线数据库查看ANP32E在宫颈癌及正常对照组织中的表达量;对下载的宫颈癌数据利用affy包读取affymetix的基因表达芯片的CEL格式数据,采用RMA（Robust Multichip Averaging）算法对数据进行背景校正及标准化,进而探究ANP32E在宫颈癌组织中的表达水平,利用limma包按照FDR<0.05、|log2（Fold Change）|>1筛选标准查找差异表达基因,并对其进行KEGG富集分析;按照ANP32E的表达值排序,将TCGA宫颈癌数据进行单基因GSEA分析;用组织芯片检测ANP32E蛋白在宫颈癌和癌旁的表达情况。进一步我们通过细胞和动物实验探究ANP32E在宫颈癌中的作用,首先构建ANP32E基因干扰慢病毒载体,转染宫颈癌细胞株,通过CCK-8法检测该基因干扰后对宫颈癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期变化;流式细胞术及Caspase3/7活性检测细胞凋亡水平;Western Blot方法检测ANP32E蛋白表达水平;宫颈癌裸鼠皮下异种移植瘤模型来确定该基因在体内对宫颈癌细胞的影响。最后对敲低ANP32E基因的宫颈癌细胞株和未处理的宫颈癌细胞株做表达谱芯片实验,利用affy包读取数据,RMA算法进行数据标准化,以|Fold Change|≥ 1.2且P<0.05为标准筛选差异表达基因,对这些差异表达基因进行KEGG富集通路分析,并导入IPA软件进行分析,同时对正常组和敲减组的芯片数据进行GSEA富集分析,进一步选择抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡的基因,对这些基因进行q-PCR、Western Blot 检测验证。[结 果]通过GEPIA2在线数据库分析结果显示,ANP32E基因在宫颈癌组织中高表达,在正常对照中低表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。在三套宫颈癌基因表达谱芯片检测数据中,该基因在肿瘤组织中均显著上调表达（P<0.05）。组织芯片实验发现ANP32E蛋白表达水平在癌组织中比癌旁组织有较高的表达量,且差异具有统计学意义（P<0.05）。GSEA富集结果显示高表达ANP32E组主要富集p53信号通路,卵母细胞减数分裂,细胞周期等通路;筛选得到的差异表达基因主要富集在细胞周期,DNA复制,卵母细胞有丝分裂,以及p53信号通路等。shANP32E组宫颈癌细胞与shCtrl组相比,细胞增殖抑制明显;CCK-8实验结果表明,相比于正常对照组,敲减ANP32E基因表达的宫颈癌细胞增殖减缓;流式细胞术结果显示,在Hela细胞株中,与shCtrl组相比,shANP32E组处于G1期的细胞无显著变化,处于S期的细胞减少（P<0.05）,处于G2/M期的细胞增多（P<0.05）;在SiHa宫颈癌细胞株中,shANP32E组处于S期、G1期的细胞无显著变化,处于G2/M期的细胞增多（P<0.05）;FACS细胞凋亡检测和caspase3/7检测实验结果表明,ANP32E基因敲减后,细胞的凋亡数增多（P<0.05）。在动物成瘤实验中,相比于正常组,活体成像结果显示敲减组荧光表达量降低,并且瘤体体积、瘤体重量都减小（P<0.05）。对敲减细胞株的芯片数据进行分析,筛选得到538个上调和538个下调差异基因,主要富集在细胞周期、p53信号通路、TNF信号通路、细胞复制、细胞凋亡等通路;利用IPA软件对差异表达基因进行分析,发现它们与肿瘤、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等疾病与功能有关;GSEA分析结果显示细胞周期、DNA复制、卵母细胞减数分裂等在正常组中富集;q-PCR 实验表明与 NC 组相比,KD 组中 ANP32E、BIRC5、CCNE1、CDK4、RLK1、STMN1表达量下降（P<0.05）,ANXA1、CASP8、CDKN2B、DDIT3、EIF2AK2、GADD45A、IRF1、IRS1、JUN、MAP3K1、RHOB、STAT1、TES、TGFBR1、TGFBR2、TNFRSF10B、TRIM22 在 KD 组中表达量上调（P<0.05）;进一步进行Western Blot实验验证,与正常组相比,CDKN2B、DDIT3、JUN、STAT1、TGFBR2在敲减组中上调（P<0.05）,STMN1蛋白在敲减组中表达下调（P<0.05）。[结 论]ANP32E基因在宫颈癌组织及宫颈癌细胞株中高表达,该基因促进细胞的增殖、紊乱细胞周期、抑制细胞凋亡,并且ANP32E在宫颈癌细胞中可能通过调控 CDKN2B、DDIT3、JUN、STAT1、TGFBR2、STMN1 等基因在宫颈癌发生发展中发挥作用。
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