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研究背景糖尿病下肢血管病变（Diabetic lower extremity arterial disease,DLEAD）,是糖尿病大血管并发症之一,主要病因为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）,其发病率逐年攀升,是引起糖尿病患者非外伤截肢的的首位因素,严重威胁患者的健康及生活。经皮腔内血管成形术（percutaneous transluminal angioplasty,PTA）是当前临床治疗 DLEAD的首选方法,但术后的再狭窄（restenosis,RS）发生率居高不下,极大制约了 PTA临床疗效和应用。有效防治PTA术后再狭窄是当前改善DLEAD疗效的焦点。我们前期研究发现不同于动脉粥样硬化病变,再狭窄病变中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表现出独特的生物学特征:过度的增殖与迁移能力,而Lin28a在其中发挥重要作用。miR98通常在分化的细胞中高表达,具有高度保守的序列和功能,参与调控细胞增殖、分化、死亡等生命过程。既往研究指出miR98与Lin28a可参与调控癌细胞的增殖迁移,但两者之间的调控机制对于血管平滑肌细胞的增殖迁移作用未见研究。本研究以此为重点,探究再狭窄病变中miR98/Lin28a调控VSMCs的增殖和迁移的具体机制。为防治糖尿病下肢血管病变PTA后的再狭窄病变提供新思路、新方向。研究目的1.通过“双损伤手术”构建大鼠髂动脉再狭窄模型,明确miR98和Lin28a参与再狭窄病变的发生。2.通过调控血管平滑肌细胞中miR98和Lin28a的表达,探究再狭窄病变中miR98通过Lin28a调控VSMCs增殖和迁移的具体分子机制。研究方法1.2型糖尿病大鼠髂动脉AS与RS模型的构建:（1）应用高脂饮食喂养+小剂量STZ单次注射+球囊扩张拉伤术构建大鼠髂动脉AS模型。（2）应用高脂饮食喂养+小剂量STZ单次注射+球囊扩张拉伤术+PTA手术进行大鼠髂动脉RS模型构建。2.AS与RS斑块检测与血管标本采集:球囊扩张拉伤术或PTA手术后4周,使用多普勒超声检查斑块的形成情况并对造模大鼠进行麻醉后灌注取材。3.免疫组化检测α-SMA在各组大鼠血管组织中的定位及表达情况。4.RT-qPCR检测AS/RS血管组织中miR98和Lin28a的表达水平。5.原代VSMCs的提取与培养:剥离法获得原代VSMCs后,于环境为37℃,5%CO2的培养箱中进行培养。6.上调/下调Lin28a的慢病毒对VSMCs进行转染,构建稳转细胞株:（1）慢病毒感染预实验,病毒复感染指数（MOI）检测:取四个数量级MOI值,向VSMCs转染慢病毒,记录转染效率达到80%左右时细胞的生长情况、此组的MOI值及转染条件以备正式实验使用。（2）Lin28a的慢病毒正式转染:根据预实验得到的最佳MOI与转染条件对细胞进行转染,转染72小时后用荧光显微镜观察细胞中病毒转染情况。（3）RT-qPCR 与 Western blot 检测 VSMCs 中 Lin28a 的表达情况。7.向稳定上调与下调Lin28a的VSMCs或正常VSMCs中转染miR98的模拟物或抑制剂:（1）将miR98模拟物或抑制剂和Lipofectamine 2000混合液转染至稳转Lin28a细胞株或者普通VSMCs株中。（2）RT-qPCR对转染miR98的模拟物或抑制剂后的VSMCs中miR98和Lin28a表达情况进行检测。（3）Western blot 检测 VSMCs 中 Lin28a 的表达情况。8.EdU细胞增殖检测:对不同处理组的VSMCs行EdU细胞增殖检测,应用荧光显微镜观察96孔板中VSMCs的EdU染色情况并拍照计数。9.Transwell细胞迁移实验检测不同处理组的VSMCs的迁移能力。10.统计学分析:所有的统计分析都使用SPSS 22.0进行。两组数据间的比较采用t检验,多组数据之间的比较使用单因素方差分析。全部数据以平均值±标准差（mean±SD）来表示,组间差异的统计学意义设定为P＜0.05（双侧）。所有实验重复三次以上后进行统计学分析。研究结果1.再狭窄斑块呈现出与动脉粥样硬化斑块不同的病理生理特征。VSMCs的过度迁移和增殖为PTA术后RS病变发生的主因。与动脉粥样硬化斑块相比,再狭窄病变表现出独特的病理生理特征,免疫组化结果显示再狭窄斑块中血管平滑肌细胞的数量明显升高。同时RT-qPCR结果显示,再狭窄斑块组织中Lin28a的表达明显升高,而miR98的含量与动脉粥样硬化斑块组织中的含量相比有所降低（P＜0.05）,结果表明miR98和Lin28a参与了再狭窄病变的形成。2.在再狭窄斑块中,Lin28a能够促进血管平滑肌细胞的增殖迁移。转染上调、下调Lin28a的慢病毒以及对应阴性对照慢病毒于VSMCs,Western blot验证转染后VSMCs中Lin28a被成功调控且可稳定发挥作用。EdU和Transwell检测调控Lin28a表达后的VSMCs中增殖和迁移能力变化,结果显示上调Lin28a可以促进血管平滑肌细胞的增殖迁移,而抑制Lin28a可以抑制血管平滑肌细胞的增殖迁移,即Lin28a对VSMCs增殖迁移具有调控作用（P＜0.05）。3.在血管平滑肌细胞中,miR98能够抑制VSMCs迁移和增殖。于VSMCs中分别转染miR98模拟物和抑制剂,RT-qPCR证实VSMCs中miR98的表达被成功调控（P＜0.05）。随后EDU和Transwell分别检测miR98模拟物或抑制剂转染后VSMCs的增殖和迁移能力,结果证实与对照组相比,miR98能够抑制VSMCs增殖迁移能力（P＜0.05）。4.在再狭窄斑块的血管平滑肌细胞中,Lin28a是miR98的下游靶点。由于miR98的过量表达可以抑制VSMCs的增殖和迁移。转染miR98模拟物和抑制剂于VSMCs中,RT-qPCR验证转染后VSMCs中miR98被成功调控且可稳定发挥作用。随后使用RT-qPCR检测调控miR98表达后的VSMCs中Lin28a的表达,结果显示上调miR98可以抑制Lin28a的表达,而抑制miR98可以促进Lin28a的表达,结合体内外结果我们总结分析Lin28a是受miR98抑制调控的下游靶点（P＜0.05）。5.miR98能够通过抑制Lin28a的表达调控VSMCs迁移和增殖。于转染了 Lin28a慢病毒的VSMCs中进行miR98模拟物或抑制剂的二次转染,随后使用EDU和Transwell对调控后的血管平滑肌细胞增殖和迁移能力进行检测,结果显示同时调控Lin28a的表达能够“挽救”单独调控miR98引起的VSMCs的增殖和迁移能力的变化（P＜0.05）,证实miR98能够通过抑制下游的Lin28a调控VSMCs迁移和增殖。研究结论1.动脉粥样硬化与再狭窄病变呈现出不同的病理生理特征,miR98和Lin28a参与了再狭窄病变的发生。2.在VSMCs中,Lin28a是受miR98抑制调控的下游靶点,miR98能够通过抑制Lin28a的表达对VSMCs的增殖和迁移产生抑制作用。