研究目的和背景近年来结直肠癌已成为全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国恶性肿瘤发病率中位列第三,大部分结直肠癌患者治疗方法不理想,术后复发率高,而结直肠癌细胞的转移作为结直肠癌发展进程中的关键事件,直接影响临床结直肠癌患者的治疗和预后,因此研究结直肠癌转移的分子机制及其调控因素对预防和治疗结直肠癌以及提高患者生存率具有重要意义。促肝细胞再生磷酸酶-3（Phosphαtase of regenerating liver 3,PRL-3）是现已发现与结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一,前期研究发现PRL-3可以通过JMJD家族调控H3K9甲基化并且通过免疫共沉淀方法及质谱鉴定获得了一些与PRL-3可能有直接相互作用的蛋白,其中包括是泛素特异性蛋白酶4（USP4,Ubiquitin Specific Peptidase 4）,接下来我们进一步研究了USP4与PRL-3信号之间的交互作用以及在结直肠癌的发生发展及转移过程中的作用。另一方面,有报道称PRL-3可以通过miRNA途径影响肿瘤的发生,而Dicer是miRNA产生过程中的关键酶。近期研究证实Dicer对于许多肿瘤来说是作为一个抑癌基因,在肿瘤组织中低表达,例如胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等,对此我们进一步研究Dicer在结直肠癌中的作用以及PRL-3是否可以参与调控这一过程。一、USP4通过去泛素化及稳定PRL-3参与结直肠癌的发生及转移1、在临床结直肠癌标本中检测USP4的表达选取36例临床结直肠癌配对组织样本提取RNA,通过逆转录-荧光定量PCR技术检测USP4 mRNA表达水平;随机选取5例临床结直肠癌配对组织提取蛋白,通过WestemBlot技术检测USP4蛋白表达水平;选取86例临床结直肠癌配对样本组织芯片进行免疫组化染色,并对患者临床资料进行分期,初步确定USP4与及直肠癌患者临床病理特征之间的关系。2、稳定敲低USP4对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响利用慢病毒载体技术构建USP4稳定敲低的结直肠癌细胞株SW480、HCT116,通过Western Blot及Real-time PCR验证干扰效果,选取干扰效果较好的两个片段命名为 SW480/shRNA1、SW480/shRNA2、HCT116/shRNA1、HCT116/shRNA2;通过平板克隆形成实验、MTT细胞增殖能力测定、划痕实验、Migration迁移实验、Invasion侵袭实验观察USP4稳定干扰后对及直肠癌细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响;通过对裸鼠进行皮下注射及尾静脉注射USP4稳定干扰的结直肠癌细胞及对照结直肠癌细胞,观察裸鼠皮下成瘤及肺转移情况。3、USP4影响PRL-3参与的AKT通路和上皮性标记物E-cadherin表达结直肠癌细胞干扰或过表达USP4后通过Western Blot观察p-AKT与E-cadherin表达情况,检测AKT通路是否被激活及上皮性标记物E-cadherin的表达。皮下注射USP4稳定干扰的结直肠癌细胞及对照结直肠癌细胞成瘤后提取瘤组织蛋白通过Western Blot检测p-AKT与E-cadherin表达情况。尾静脉注射USP4稳定干扰的结直肠癌细胞及对照结直肠癌细胞,6周后取肺组织通过免疫组化实验检测p-AKT与E-cadherin表达情况。4、USP4影响PRL-3蛋白表达结直肠癌细胞中在有或无PRL-3过表达的情况下瞬时过表达或干扰USP4后通过Western Blot及荧光定量PCR实验检测内源性以及外源性PRL-3的表达。结直肠癌细胞在外源性PRL-3存在的情况下通过瞬时过表达或干扰USP4,经过蛋白质合成抑制剂CHX（Cycloheχimide from microbial）放线菌酮处理后不同时间点收取细胞蛋白,Western Blot实验检测RPL-3蛋白表达。5、USP4去泛素化PRL-3且与PRL-3存在直接相互作用外源性过表达USP4与PRL-3后,通过免疫共沉淀检测两者是否存在外源性相互作用。提取结直肠癌细胞SW480细胞,通过免疫共沉淀进一步验证两者是否存在内源性的相互作用。结直肠癌细胞SW480应用细胞免疫荧光实验检测USP4与PRL-3在细胞中的定位。在过表达的PRL-3与HA-ubiquitin基础上瞬时过表达或干扰USP4,经过蛋白酶体抑制剂MG132处理后,应用免疫共沉淀检测USP4对PRL-3泛素化的影响。6、PRL-3参与USP4对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响在稳定干扰USP4的结直肠癌细胞中,在USP4稳定敲低的结直肠癌细胞中重新过表达PRL-3,通过平板克隆形成实验、MTT细胞增殖能力测定、划痕实验、Migration迁移实验、Invasion侵袭实验观察PRL-3过表达后能否恢复USP4敲低后对结直肠癌细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。7、结直肠癌细胞系与临床结直肠癌组织中USP4与PRL-3相关性检测与分析八株结直肠癌细胞通过Western Blot及逆转录-荧光定量PCR实验分别检测USP4与PRL-3蛋白与mRNA水平的表达。86例临床结直肠癌配对样本组织芯片进行USP4与PRL-3免疫组化染色,分析USP4与PRL-3相关性。二、PRL-3可以影响Dicer在结直肠癌中的抑癌作用1、Dicer在结直肠癌细胞中表达情况及PRL-3对其影响在8株结直肠细胞中检测Dicer蛋白表达;在HCT-8、DLD-1、LoVo、HCT116中上调PRL-3后通过Western Blot观察Dicer蛋白表达情况。2、肠上皮特异性纯合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/loxp Villin-Cre）生存率低且有肠发育障碍通过对出生1-30天的小鼠观察大小、体重及生存状况,应用PCR技术进行基因型鉴定,分析肠上皮特异性纯合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/loxpVillin-Cre）、杂合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/+Villin-Cre）及野生型对照小鼠（WT）生存状况。取Dicer loxp/loxp V llin-Cre小鼠及同窝WT小鼠肠组织,石蜡包埋HE染色观察。3、观察Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠与WT小鼠对急性肠炎的易感性随机选取Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠饮用3%DSS或2.5%DSS诱导急性肠炎模型及修复模型,通过测量体重及结直肠重量与长度比、观察小鼠生存时间、HE染色镜下炎症评分及mRNA水平的炎症因子检测,比较Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠在急性肠炎模型及修复模型中的严重程度。4、观察Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠与WT小鼠对肠炎相关性结直肠癌的易感性随机选取Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠,采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）方法诱导小鼠肠炎相关性结直肠癌模型,通过观察肿瘤大小、计算肿瘤个数、测量肿瘤体积、HE染色及结直肠癌评分比较Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠成瘤能力。5、通过分子实验检测Dicer肠上皮缺失小鼠Dicer的表达情况取肠上皮特异性纯合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/loxpVillin-Cre）、杂合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/+Villin-Cre）及野生型对照小鼠（WT）肠组织蛋白及RNA通过Western Blot及荧光定量PCR检测Dicer表达情况。结果一、USP4通过去泛素化及稳定PRL-3参与结直肠癌的发生及转移1、USP4在人结直肠癌组织中高表达,且与肿瘤大小、分化程度及远处转移相关临床结直肠癌配对组织样本mRNA及蛋白检测结果均显示67%的USP4在结直肠癌组织中表达高于癌旁组织,差异具有显著性（t=3.219,P=0.003）;免疫组织化学结果进一步显示USP4主要定位与胞浆,且USP4的表达高低与结直肠癌患者的肿瘤大小、肿瘤的分化程度及远处转移密切相关,差异具有显著性（肿瘤大小:χ2=6.328,P=0.042;分化程度:χ2=7.931,P=0.019;远处转移:χ2=3.580,P=0.033）,而与临床病理的其他参数包括性别、年龄、TNM分期不相关（χ2值分别为0.086、0.059、0.019;P值分别为0.769、0.808、0.891）。2、稳定敲低USP4抑制结直肠癌细胞体内外增殖、迁移、侵袭能力MTT细胞增殖能力测定结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480和HCT116均较对照组细胞体外增殖能力下降,差异具有显著性（SW480:F=223.274,P=0.000;HCT116:F=599.510,P=0.000）;平板克隆形成实验结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480和HCT116均较对照组细胞克隆形成能力下降,差异具有显著性（SW480:F=43.094,P=0.000;HCT116:F=145.349,P=0.000）;划痕实验结果也显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480较对照组细胞体外迁移能力下降,差异具有显著性（F=170.49,P=0.000）;Migration迁移实验结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480和HCT116均较对照组细胞体外迁移能力下降,差异具有显著性（SW480:F=43.597,P=0.000;HCT116:F=479.053,P=0.000）;Invasion侵袭实验结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480和HCT116均较对照组细胞体外侵袭能力下降,差异具有显著性（SW480:F=27.281,P=0.000;HCT116:F=51.457,P=0.000）。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480和HCT116均较对照组细胞皮下肿瘤生长速度减慢,差异具有显著性（SW480:F=124.153,P=0.000;HCT116:F=111.325,P=0.000）,体积减小、重量下降,差异具有显著性（SW480 t=3.540,P=0.012;HCT116:t=2.704,P=0.035）;裸鼠尾静脉注射结直肠癌细胞构建肺转移模型结果显示,稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480较对照组裸鼠肺转移肿瘤个数显著下降,差异具有显著性（t=3.273,P=0.017）。3、USP4可以激活依赖PRL-3的AKT信号通路以及上调上皮性标记物E-cadherin的表达结直肠癌细胞SW480中过表达USP4后Western Blot结果显示p-AKT表达上调,但总AKT表达量不变,同时上皮性标记物E-cadherin表达下调,继续过表达PRL-3后p-AKT表达量又下降,而E-cadherin表达量有所回复;结直肠癌细胞SW480稳定干扰USP4后,结果同过表达正好相反。在三株结直肠癌细胞SW480、LoVo、LS174T中瞬时干扰USP4后,E-cadherin蛋白表达上调。结直肠癌细胞SW480过表达PRL-3后,Western Blot结果显示E-cadherin表达下调,继续干扰USP4后E-cadherin表达量又有所回复。同样的结果也出现在裸鼠皮下瘤组织中,USP4的表达与PRL-3、p-AKT正相关,但与E-cadherin表达负相关。裸鼠肺转移模型免疫组化结果显示,稳定干扰USP4的肺转移瘤与对照组相比,p-AKT在胞浆位置表达较弱,而上皮性标记物E-cadherin在胞膜位置表达较强。4、USP4可以在蛋白水平上调控PRL-3表达结直肠癌细胞RKO、LS174T过表达USP4后,Western Blot检测结果显示内源性PRL-3表达升高,但荧光定量PCR结果显示内源性PRL-3在mRNA水平并无变化（t=-1.521,P=0.268）。在结直肠癌细胞SW480、RKO中同时过表达PRL-3与USP4后,Western Blot检测结果显示外源性PRL-3在USP4同时过表达时表达量也随之上调。结直肠癌细胞3W480、HCT116瞬时干扰USP4后,Western Blot检测结果显示内源性PRL-3表达降低,同样的结果也出现在荧光定量PCR中,差异具有显著性（SW480/siRNAl、SW480/siRNA2、SW480/siRNA3 的t值分别为-5.234、-11.803、-11.654;P值分别为0.035、0.007、0.007）。结直肠癌细胞SW480同时过表达PRL-3、干扰USP4后,Western Blot检测结果显示外源性PRL-3在USP4同时被干扰时表达量明显下调。过表达USP4的结直肠癌细胞SW480经过蛋白质合成抑制剂CHX（Cycloheximide from microbial）放线菌酮处理后分别于不同时间点收取细胞蛋白,Western Blot检测结果显示随时间增加PRL-3蛋白的合成量是逐渐减少的,但过表达USP4后,PRL-3蛋白合成量与对照相比明显增加。同样的结果,干扰USP4的结直肠癌细胞SW480检测PRL-3蛋白表达量在干扰USP4后明显下降。5、USP4去泛素化PRL-3且与PRL-3存在直接相互作用外源性过表达USP4与PRL-3后,通过免疫共沉淀检测两者存在外源性相互作用。提取结直肠癌细胞SW480细胞,通过免疫共沉淀进一步验证两者存在内源性的相互作用。结直肠癌细胞SW480应用细胞免疫荧光实验结果显示USP4与PRL-3在结直肠癌细胞中均定位于胞浆。在HEK293T细胞中过表达PRL-3与HA-ubiquitin基础上瞬时过表达或干扰USP4,经过蛋白酶体抑制剂MG132处理后,免疫共沉淀实验结果显示USP4可以去泛素化PRL-3。6、PRL-3参与USP4对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响在稳定干扰USP4的结直肠癌细胞SW480中同时过表达PRL-3,MTT细胞增殖能力测定实验结果显示细胞体外增殖能力较稳定干扰USP4时有所回升,差异具有显著性（F=1253.066,P=0.000）;平板克隆形成实验结果显示细胞克隆形成能力较稳定干扰USP4时有所回升,差异具有显著性（F=60.751,P=0.000）;划痕实验结果显示细胞体外迁移能力较稳定干扰USP4时有所回升,差异具有显著性（F=1061.088,P=0.000）;Migration迁移实验结果显示细胞体外迁移能力较稳定干扰USP4时有所回升,差异具有显著性（F=327.416,P=0.000）;Invasion侵袭实验结果显示细胞体外侵袭能力较稳定干扰USP4时有所回升,差异具有显著性（F=453.700,P=0.000）。7、在结直肠癌细胞系与临床结直肠癌组织中USP4与PRL-3在蛋白水平上存在相关性八株结直肠癌细胞SW620、LoVo、RKO、SW480、HCT116、DLD-1、LS174T、Caco-2通过Western Blot及逆转录-荧光定量PCR实验分别检测USP4与PRL-3蛋白与mRNA水平的表达,结果发现在蛋白水平上USP4与PRL-3具有相关性;而在mRNA水平上不具有相关性,差异不具有显著性（结直肠癌细胞mRNA水平R=0.143,P=0.736）。在86例临床结直肠癌配对样本组织芯片中对USP4与PRL-3进行免疫组化染色分析结果显示USP4与PRL-3存在正相关,差异具有显著性（R=0.621,P=0.000）。二、PRL-3影响Dicer在结直肠癌中的抑癌作用1、Dicer蛋白表达与细胞恶性程度负相关,PRL-3可以影响Dicer表达在8株结直肠癌细胞中通过Western Blot检测发现随着细胞恶性程度增加,Dicer 表达逐渐下降;HCT-8、DLD-1、Lo Vo、HCT116 中瞬时过表达 PRL-3 后 Western Blot结果显示Dicer表达均下调。2、Dicerloxp/loxpVillin-Cre小鼠生存率低且有肠发育障碍出生1-30天的小鼠通过观察大小、体重及生存状况发现Dicerloxp/loxp Villin-Cre小鼠生存时间显著短于Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠与WT小鼠,差异具有显著性（Dicerloxp/loxpVillin-Cre与WT比,χ2=34.108,P=0.000;Dicerloxp/+loxpVillin-Cre与Dicerloxp/+Villin-Cre 比,χ2=23.472,P=0.000）;Dicerloxp/+Villn-Cre小鼠与WT小鼠相比,生存时间无显著差异（χ2=1.987,P=0.159）。取DicerloxP/Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠肠组织,石蜡包埋HE染色观察结果显示Dicer loxp/loxp Villin-Cre小鼠相比于同窝WT小鼠腺体发育不完全,绒毛结构异常,淋巴结数量明显增多。3、Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠更易诱发肠炎随机选取Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠饮用3%DSS诱导急性肠炎模型,结果发现Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠体重下降程度、结直肠重量与长度比值、HE染色镜下炎症程度均显著高于同窝WT小鼠,差异具有显著性（结直肠重量与长度比:t=8.595,P=0.000;体重下降程度:F=28.568,P=0.019;炎症程度:χ2=7.847,P=0.049）,病变深度及隐窝破坏范围两组小鼠均很严重,差异不具有显著性（病变深度:X2=2.381,P=0.123;隐窝破坏范围:χ2=3.161,P=0.367）。炎症因子检测结果显示,Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠TNF-α、IL-1β及MCP-1的含量与同窝WT小鼠相比差异没有显著性（TNF-α、IL-1 β、MCP-1t值分别为0.055、0.777、0.384;P值分别为0.957、0.447、0.705）。随机选取Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠饮用2.5%DSS诱导急性修复肠炎模型,结果发现Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠生存时间显著短于同窝WT小鼠,差异具有显著性（χ2=8.545,P=0.003）,Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠体重下降程度、HE染色镜下炎症程度、病变深度及隐窝破坏范围均显著高于同窝WT小鼠,差异具有显著性（体重下降程度F=98.078,P=0.000;炎症程度、病变深度及隐窝破坏范围χ2值分别为 11.250、10.000、10.024;P值分别为0.010、0.019、0.040）。炎症因子检测结果显示,Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠TNF-α、IL-1 β及MCP-1的含量与同窝WT小鼠相比显著升高,差异具有显著性（TNF-α、IL-1β、MCP-1t值分别为3.955、4.264、3.945,P值分别为0.005、0.005、0.017）。4、Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠更易诱发肠炎相关性结直肠癌选取Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠及同窝WT小鼠采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）方法诱导小鼠肠炎相关性结直肠癌模型,结果发现Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠结直肠成瘤数量、体积、重量都显著高于同窝WT小鼠,差异具有显著性（肿瘤个数、肿瘤最大径、结直肠重量长度比的t值分别为9.109、10.834、6.588,P值分别为0.000、0.000、0.000）,HE染色镜下观察结果显示Dicerloxp/+Villin-Cre小鼠与同窝WT小鼠比较肿瘤恶化程度更高。5、分子检测发现Dicer肠上皮缺失小鼠肠组织Dicer表达下降取肠上皮特异性纯合敲除Dicer小鼠（Dicer loxp/loxpVillin-Cre）、杂合敲除Dicer小鼠（Dicerloxp/+Villin-Cre）及野生型对照小鼠（WT）肠组织蛋白及RNA通过Western Blot及荧光定量PCR检测发现Dicer在野生型、肠上皮杂合缺失及纯合缺失Dicer小鼠中蛋白及RNA表达逐渐下降,差异具有显著性（F=199.487,P=0.000）。结论一、USP4通过去泛素化及稳定PRL-3参与结直肠癌的发生及转移USP4在人结直肠癌组织中高表达,且与肿瘤大小、分化程度及远处转移正相关;稳定敲低USP4后可以抑制结直肠癌细胞体内外增殖、迁移、侵袭能力;USP4可以激活PRL-3参与的AKT通路,且与上皮性标记物E-cadherin表达负相关;USP4影响PRL-3的蛋白表达,不影响mRNA表达;USP4去泛素化PRL-3且与PRL-3存在直接相互作用;PRL-3可以逆转干扰USP4后所抑制的结直肠癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力;在结直肠癌细胞系与临床结直肠癌组织中USP4与PRL-3在蛋白水平上正相关,而在mRNA水平上未见明确相关性。二、PRL-3影响Dicer在结直肠癌中的抑癌作用Dicer表达与结直肠癌细胞恶性程度成负相关,上调PRL-3后Western Blot结果显示Dicer表达降低;肠上皮特异性纯合敲除Dicer（Dicerloxp/loxpVillin-Cre）小鼠与野生对照组（WT）相比生存率低且有肠发育障碍;肠上皮特异性杂合敲除Dicer（Dicerloxp/+Villin-Cre）小鼠更易诱发肠炎及肠炎相关性结直肠癌。