XP疾病(Xeroderma pigmentosum)是一种光损伤性疾病,同时又是一种常染色体隐性遗传疾病。此病临床症状表现为明显的光损伤症状,即在皮肤暴露区域出现明显的色素沉着斑,伴发眼部损伤或神经系统异常。此病最大的风险因素在于患者易患肿瘤并且具有较高的复发率。XP-V疾病是XP疾病中比较常见的一个亚型,其与其它亚型均具有共同的光损伤临床表现,唯一区别在于XP-V疾病尚无神经系统异常的报道。尽管XP-V在XP疾病中拥有较高的发病率,但关于此病的深入临床研究并不多见。大多数XP-V病人均患有肿瘤,少数病人未发现肿瘤可能因为年龄较小病情还未发展至肿瘤发生。口腔颌面部由于经常接触阳光照射,是XP肿瘤的高发区域,此区域拥有眼、鼻、唇、耳等多个重要器官,这些器官均有发生XP-V肿瘤的报道,但尚未有研究涉及XP-V肿瘤在口腔颌面部的分布特点。XP疾病分为XP-A至XP-G以及XP-V八种亚型,每种亚型的致病基因各不相同。其余亚型致病基因均参与DNA光损伤产物的核酸内切修复机制,这些基因功能障碍导致DNA光损伤产物不能顺利清除,最终导致XP疾病发生。而XP-V亚型致病基因明确为POLH基因,此基因编码DNA聚合酶η,参与DNA跨损伤修复机制。当聚合酶η功能障碍导致跨损伤修复过程无法顺利进行,DNA光损伤产物在复制中无法得以纠正,造成细胞基因组损伤累加,因此导致细胞功能紊乱并易诱发肿瘤。人类POLH基因定位于6号染色体上p21.1区域,Ensembl数据库中记录的最长转录本拥有11个外显子,按照CCDS数据库记录的转录本编码713个氨基酸组成的肽链。其中,N端的511个氨基酸涵盖了聚合酶η的功能区域,C端的120个氨基酸为核定位区域,中间的氨基酸尚未明确功能。目前,有关POLH基因的突变类型已报很多,突变位点涉及聚合酶η肽链的N端、C端和中间区域。但尚未有研究统计突变在基因编码区的分布特点以及是否有突变高发位点存在。由于POLH基因是目前XP-V疾病的唯一已知致病基因,几乎所有关于XP-V疾病的病因研究均仅限于POLH基因的突变报道。尚无研究寻找除聚合酶η功能障碍因素外,是否存在其它因素易导致XP-V肿瘤发生。已有研究显示,聚合酶η、κ、ζ也能参与DNA跨损伤修复过程,但相比聚合酶η而言,这些酶具有较高的错配率。另有研究表明在人类免疫球蛋白基因维持自身高变异的过程中,聚合酶θ能够执行与聚合酶η相同的功能,即执行碱基A/T的颠换。既然这些聚合酶均与聚合酶η拥有相似的功能,那么有可能当聚合酶η功能障碍时,这些聚合酶也会随之发生表达变化。因此,这些聚合酶在XP-V细胞中是否存在表达变化以及这些变化是否与XP-V疾病发展有关系,值得进一步研究。实验设计：1、临床收集XP-V病人,通过以往文献统计研究XP-V肿瘤在口腔颌面部的分布特点。对收集的XP-V病人进行POLH基因编码区的筛查,分析可能存在的突变。2、构建具有突变类型的质粒载体,通过转染载体入细胞系,观察突变蛋白是否存在功能障碍。3、构建XP-V肿瘤细胞及正常对照细胞紫外线损伤模型,研究当聚合酶η存在功能障碍时,细胞在遭受紫外线损伤前后其聚合酶τ、κ、e、ζ是否也发生表达改变。同时比较XP-V细胞系与HSF细胞系在紫外线照射前后上述蛋白的表达水平,验证在XP-V肿瘤细胞中发现的表达异常基因。并通过对HeLa细胞系进行POLH基因表达抑制,再次验证聚合酶τ、κ、θ、ζ是否随着聚合酶η的表达降低而随之出现表达改变。总结上述聚合酶的表达变化,探讨其与XP-V疾病肿瘤发生的关系。材料和方法：1、在知情同意原则下于武汉大学口腔医学院颌面外科病房收集一例XP-V病人,采集其血样DNA,并培养其下唇肿瘤组织细胞,提取其淋巴细胞建立永生化细胞株。同时于病房收集三例唇裂修补手术患者,利用唇裂手术中切下的正常唇红组织培养正常对照组织细胞。2、应用聚合酶链反应和DNA测序分析方法,寻找XP-V病人POLH基因存在的突变,通过总结已有突变类型,研究POLH基因突变位点的分布特点。3、分析本研究发现突变可能导致的蛋白功能障碍。将突变序列与正常序列分别克隆至pEYFP-C1载体中,再将载体转染入HeLa细胞系,观察突变蛋白在细胞系中是否存在功能障碍。4、设计特异性针对POLH基因的SiRNA,对HeLa细胞系进行RNA干扰实验。培养XP-V肿瘤细胞与正常对照细胞,XP-V细胞系与HSF细胞系,POLH基因表达受抑制的HeLa细胞与基因表达正常的HeLa细胞。将上述三组细胞置于紫外线下照射,构建其细胞损伤模型。利用Real-time PCR及Western blot分析方法,观察上述三组细胞在紫外线照射前后,细胞内聚合酶η、τ、K、θ、ζ的表达量。结果：1、本研究收集的XP-V病人具有典型的光损伤临床症状。通过统计XP-V肿瘤报告发现我国XP-V肿瘤在口腔颌面部最易累及鼻部器官,病理类型以鳞癌最多。2、直接测序法发现病人基因组存在一个新的突变(g. IVS4+7307--IVS9+1414Del),该突变在cDNA水平表现为c.491-1074Del (Del Exon5-9)综合分析已有文献表明,POLH基因突变无突变“热点”或突变“热区”。3、含有突变序列的质粒载体所编码的突变聚合酶η在HeLa细胞系中完全不能入核。4、本实验采取的紫外线照射能显著引起细胞损伤。XP-V细胞中聚合酶K、θ、ζ含量低于正常表达水平,这将影响DNA跨损伤修复效率。在经受紫外线照射损伤后,聚合酶κ、θ、ζ含量又明显高于正常表达水平,这将引起DNA复制时高错配的发生。在HeLa细胞中,无论细胞是否受到紫外线照射损伤,聚合酶K、e、ζ的表达量均随着聚合酶η的表达下降而降低。结论：1、本研究发现的新突变编码一个仅含164个氨基酸的截短蛋白。此突变蛋白完全丧失了细胞核定位能力以及原有酶功能。2、聚合酶κ、θ、ζ的表达量受到聚合酶η的表达影响,当聚合酶η表达受到抑制后,聚合酶K、θ、ζ表达也随之下降。在XP-V细胞中,这些酶的表达异常将加速细胞基因组紊乱,容易诱发肿瘤。遗传性牙龈纤维瘤病(Hereditary gingival fibromatosis, HGF)是一种缓慢渐进性的以牙龈增生为主要病变表现的遗传性疾病。遗传方式为常染色体显性遗传,也有少数病例表现为没有家族史的散发病例。根据是否合并有其它疾病,HGF可以分为综合征型与非综合征型。前者指除了牙龈增生症状还有身体其它系统的临床表现,比如毛发、神经系统异常等。而后者仅有牙龈增生的症状,无其它系统疾病。口腔门诊见到的HGF病例往往都是非综合征型的病例。牙龈增生作为非综合征型HGF的唯一症状,其微观病理表现为细胞外间质胶原的沉积。目前已有众多因素证实与牙龈间质纤维化相关,比如TGF-β1、MMPs等因子。这些因子表达失衡都利于胶原分子的合成或聚集。关于HGF牙龈增生风险因子的研究已有很多,但其主要的遗传致病基因仍未被发现。有关HGF致病基因的寻找工作仅限于发现了GINGF1-GINGF4的四个候选基因座,目前仅确定GINGF1内的SOS1基因在一个HGF家系中存在移码突变,但未有第二个家系佐证存在SOS1突变,且有研究表明HGF具有显著的遗传异质性。这些都说明研究HGF主要致病基因工作尚无进展且存在明显的难度。研究遗传病的首要条件就是需要尽量丰富的遗传病样本。家系收集成为遗传病研究工作必不可少的重要环节。本课题组在先前有关HGF致病因素的研究过程中,已收集了十几个家系,并利用其中一个大家系发现了HGF的一个候选基因座：GINGF3。但先前的研究手段连锁分析法仅能将GINGF3在染色体上的范围确定,不能精确定位至某一个候选基因。因此,尚需要大量工作去寻找GINGF3内的致病基因。这也是本研究的主要目的。此外,由于遗传病研究中家系的重要性,本研究在寻找致病基因的工作中,也注意随时收集门诊上遇到的HGF家系,尽可能多的收集HGF病例资料、DNA遗传资源、病变组织与病变组织细胞。新增收集家系为以后其它HGF相关研究工作提供基础资源。先前的研究划定了GINGF3在2号染色体上的清晰界限,但其范围跨度较大,内部包含100多个基因,不易确定众多基因之中哪些才是有价值的候选基因。寻找基因突变位点传统的方法是针对基因序列设计引物进行PCR扩增,将扩增产物测序观察有无碱基类型改变。由于此方法耗时费力、成本较高,适用于已发现明确的候选基因且候选基因数目不多,但绝不适用于GINGF3内大规模筛查每个基因序列。大范围筛查基因需要一种高通量的测序技术,而近年来兴起的外显子组测序技术就正满足这种工作的需要。外显子组测序利用基因芯片平台可以将人类基因组大部分编码区进行有效测序,测序时效率高、精度高,一次测序即可完成几乎全基因组编码区的扫描。同时,在测序时此技术可保证每个测到的碱基拥有平均数十遍的重复测序,极大程度降低了假阳性和假阴性的出现。因此,利用此技术寻找GINGF3内致病基因是一种行之有效的方法。表达谱芯片可以发现病变组与正常组全基因组基因表达量的差异。因此,可以利用其研究HGF病变牙龈组织与正常人牙龈组织全基因组表达谱变化。观察GINGF3内众多基因中有无表达变化明显的基因,将这些基因挑选出来倘若数目不多即可利用传统PCR测序方法进行筛查。本研究希望利用两种高效的芯片检测工具,确定GINGF3内若干候选基因,进一步筛查候选基因最终发现HGF GINGF3致病基因。目的：1、采集更多的HGF家系,获取更多HGF遗传资源为以后HGF相关研究工作做准备。2、利用生物芯片工具对HGF病人DNA外显子编码区高通量扫描,寻找致病基因。3、利用生物芯片工具检测HGF病变组织GINGF3范围内基因表达谱变化,从中寻找致病候选基因。材料方法：1、详细记录武汉大学口腔医学院门诊发现的HGF病例,采集患者及亲属血样,从血样中提取基因组DNA并建立永生化B淋巴细胞株。收集患者手术切除的病变牙龈组织,并利用病变组织培养成纤维细胞。收集三例正常人牙龈组织为后续实验准备对照样本。2、选取发现GINGF3的家系中两个病人基因组DNA,将这两个样本作为家系1代表；同时选取另一个HGF大家系中三例病人基因组DNA和一例正常人基因组DNA,将这四个样本作为家系2代表。将此两个家系的代表样本送至深圳华大基因科技有限公司进行外显子组测序。将外显子组测序发现的候选基因位点在家系中验证共分离现象,并在正常人群中进行SNP验证。3、选取发现GINGF3的家系中两个病人的病变牙龈组织,与三例正常人牙龈组织一起送至晶态生物科技有限公司,利用Affy表达谱芯片分析GINGF3范围内病变组织的表达变化基因,将这些基因全部外显子区域利用PCR扩增测序,寻找是否存在突变位点。结果：1、新收集了3个HGF家系,详细记录临床资料,获得家系中部分成员的基因组DNA,并获得了一些样本的病变牙龈组织,成功培养了一些样本的牙龈成纤维细胞、永生化B淋巴细胞株。2、外显子测序发现家系1与家系2各存在一个候选基因(XDH与WDR91),这两个候选基因位点在两个家系中都符合共分离规律。但这两个变异位点在后来正常人群验证时都被证实为未报道的SNP。3、表达谱芯片结果显示在GINGF3范围内,病变组织仅有KCNK3一个基因出现了表达上调的轻微变化,但针对此基因的测序结果未发现在其外显子区域存在突变位点。结论：1、HFG病人牙龈增生程度在同一个家系可能表现度差异很大,如表现度很弱可能影响诊断。2、外显子测序技术未能发现GINGF3内致病基因。突变位点可能存在于芯片未能覆盖的外显子复杂序列区域或尚未发现的基因序列内。3、利用表达谱芯片亦未能发现GINGF3内致病基因。在GINGF3家系病人的增生牙龈中,GINGF3范围内的众多基因mRNA水平均无显著变化。