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目的:心力衰竭是临床上各种心脏疾病进展的终点,其患病率和死亡率逐年升高,是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。病理性心肌肥厚是多分子、多因素参与调控的复杂过程,是心力衰竭的独立危险因素。因此,探索病理性心肌肥厚的发生机制并寻求有效的防治措施具有深远意义。干扰素调节因子2结合蛋白2(IRF2BP2)首先作为干扰素调节因子2的转录辅助因子被发现,研究表明,IRF2BP2可以抑制动脉粥样硬化的发生发展,并在肿瘤和免疫性疾病中发挥重要作用,然而IRF2BP2与心肌肥厚及心力衰竭的关系未见报道。本课题旨在研究IRF2BP2对病理性心肌肥厚的作用,并试图阐明其作用机制。方法:1.检测靶因子IRF2BP2在心肌肥厚中的表达。A.建立小鼠主动脉缩窄术(Aortic banding,AB)诱导的心肌肥厚动物模型,免疫组织化学染色检测造模后各组小鼠左心室组织样本中IRF2BP2的表达位置及IRF2BP2表达水平的变化。Western Blotting检测造模后各组小鼠左心室组织样本IRF2BP2的表达水平。B.扩张型心肌病和肥厚型心肌病患者心力衰竭终末期行心脏移植手术后,采集被摘除的心脏左心室组织样本,Western Blotting检测IRF2BP2的表达水平,以正常心脏捐献者左心室组织样本为对照组。2.建立体外实验模型。分别构建过表达和沉默IRF2BP2的慢病毒载体Lenti-Irf2bp2及Lenti-shIrf2bp2,用构建载体转染新生大鼠原代心肌细胞,分别以过表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的 Lenti-Gfp 及表达无意义 shRNA 的Lenti-shRNA作为对照组。用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激原代心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,以PBS刺激作为对照组。用免疫荧光染色显示心肌细胞轮廓,统计单个原代心肌细胞横截面积,并用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测心肌细胞肥大标志物,综合评价IRF2BP2对体外培养的心肌细胞肥大的作用。3.建立体内实验模型。构建心肌细胞特异性Irf2bp2基因敲除小鼠,构建心肌细胞特异性Irf2bp2转基因小鼠。对构建的基因工程小鼠进行AB手术,建立心肌肥厚模型,取材前行超声心动图检查评估小鼠心脏功能,检测小鼠心脏大小和重量。通过H&E、PSR和WGA染色评价心肌细胞大小,心肌纤维化程度以及心肌细胞横截面积。使用Real-Time PCR检测心肌肥厚的标志物。通过上述多种方法综合评估IRF2BP2在AB术诱导的病理性心肌肥厚中的作用。4.检测NFAT1下游钙调神经磷酸酶调节因子1.4(Rcan1.4 的转录水平,鉴定IRF2BP2是否通过NFAT1在心肌肥厚中发挥作用。A.采集不同实验组小鼠左心室组织样本,Real-Time PCR检测Rcan1.4水平,评价IRF2BP2功能增强和功能缺失对Rcan1.4表达水平的影响。B.采集不同实验组原代心肌细胞样本,Real-Time PCR检测Rcan1.4水平,评价IRF2BP2功能增强和功能缺失对Rcan1.4表达水平的影响。C.将表达IRF2BP2和NFAT1的质粒共转染心肌细胞系H9C2,24小时后收集心肌细胞样本,Real-Time PCR检测Rcan1.4水平,评价不同浓度IRF2BP2对NFATI的转录调节作用。D.将表达IRF2BP2的质粒载体、持续性激活的NFAT1质粒载体以及荧光素酶报告基因载体共转染人胚肾(human embryo kidney,HEK)293T细胞,48小时后收集细胞,检测荧光素酶活性,评估不同水平的IRF2BP2对NFAT1的转录调节作用。5.鉴定IRF2BP2与NFAT1相互作用机制。A.利用免疫共沉淀技术证实IRF2BP2与NFAT1相互结合。B.利用6×HisPull-Down技术进一步证实IRF2BP2与NFAT1能够直接结合并相互作用。C.构建一系列IRF2BP2和NFAT1截短结构域载体,转染HEK293T细胞,利用免疫共沉淀技术探明二者相互作用的具体结构域。D.利用免疫共沉淀技术和荧光素酶报告基因实验探明IRF2BP2、MEF2C与NFAT1三者之间的关系。6.逆转实验证实IRF2BP2依赖NFAT1在病理性心肌肥厚中发挥作用。A.使用NFAT抑制剂VIVIT抑制Irf2bp2基因敲除小鼠中NFAT1活性,评估抑制NFAT1是否能够逆转Irf2b2p基因敲除小鼠心肌肥厚表型。B.构建Nfat1全身性基因敲除小鼠,将之与心肌细胞特异性Irf2bp2基因敲除小鼠杂交,再将获得的双基因敲除小鼠行AB术诱导心肌肥厚,评估Nfat1基因敲除在IRF2BP2功能缺失后心肌肥厚恶化的逆转作用。结果:1.免疫组织化学染色结果提示:IRF2BP2在心肌细胞中高表达,在小冠状动脉内皮细胞中也可见表达。AB术后2W组与Sham组相比,心肌细胞IRF2BP2表达量轻度增高,AB术后不同时间点心肌组织IRF2BP2表达量相近;Western Blotting结果提示:相比于假手术组,AB术后2W组左心室IRF2BP2表达升高,AB术后4W组及8W组与2W组表达相近,与免疫组织化学染色结果一致;与捐献者正常心脏组织相比,扩张型心肌病和肥厚型心肌病患者左心室组织IRF2BP2表达升高。2.建立敲低或过表达IRF2BP2的载体后转染新生大鼠原代心肌细胞,用Ang Ⅱ刺激原代心肌细胞后,结果提示IRF2BP2功能缺失或功能增强分别加重或减轻心肌细胞肥大。3.心肌细胞特异性Irf2bp2敲除后,压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚显著增强;反之,心肌细胞特异性Irf2bp2过表达后,压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚明显减轻。4.在体内实验中,心肌细胞特异性Irf2bp2敲除小鼠与对照组小鼠相比,心肌组织Rcan1.4表达在AB术后显著升高;反之,心肌细胞特异性Irf2bp2转基因小鼠与对照组小鼠相比,Rcan1.4表达显著降低。在体外实验中得到一致结果。使用IRF2BP2质粒和持续性激活的NFAT1质粒共转染心肌细胞系H9C2,随着IRF2BP2表达水平升高,NFAT1诱导的Rcan1.4表达逐渐降低;荧光素酶报告基因实验得到一致结果。5.IRF2BP2依赖于氨基端1-80位氨基酸结构域与NFAT1羧基端727-829位氨基酸结构域结合并发挥抑制NFAT1的作用。6.IRF2BP2不能够与MEF2C相互结合,而MEF2C能够与NFAT1相互结合,进一步证实IRF2BP2通过竞争MEF2C与NFAT1相互作用。7.VIVIT及Nfat1基因敲除均能够逆转Irf2bp2心肌细胞特异性基因敲除所致的病理性心肌肥厚加重。结论:本研究的实验结果表明,IRF2BP2病理性心肌肥厚的负调控因子,且其抑制病理性心肌肥厚主要依赖于NFAT1。因此,IRF2BP2有望成为临床防治病理性心肌肥厚的新靶点。