论文部分内容阅读
目的:基于网络药理学预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制;并以糖尿病血糖波动大鼠为研究对象,通过实验研究对参芪复方改善胰岛微循环进行疗效评价与机制探索。方法:1、以参芪复方为研究对象,运用网络药理学的研究方法,首先借助TCMSP数据库筛选参芪复方的化学组分及相关靶点,运用Cytoscape3.6.1对其“组分—靶点”进行网络拓扑学分析,通过Uniprot数据库进行官方名称校正及基因代码转换;其次,借助CTD/TTD/Drug Bank等数据库获取2型糖尿病相关靶点;将“药物—靶点”与“疾病—靶点”进行关联分析,获取参芪复方与2型糖尿病的共同作用靶点。借助STRING 11.0数据库构建其蛋白互作(PPI)网络,通过David数据库进行GO分析及KEGG通路富集分析,预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制。2、70只SD大鼠适应性喂养1周,采用链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型,将糖尿病大鼠随机分为模型组(M)、中药高剂量组(SH)、中药中剂量组(SM)、中药低剂量组(SL)、格华止组(G);此后连续8周每周2天定时予以皮下注射超短效胰岛素3U及腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.38g/(kg·d),制备糖尿病血糖波动模型;另设10只普通SD大鼠作为空白对照组(C)。各组大鼠进行血糖波动造模的同时给予相应药物干预。药物干预期间每日观察大鼠一般状态(体质量、摄食量、饮水量),每周测试1日5点血糖水平,计算各项血糖波动指数(MBG、SDBG、LABG);药物干预8周后处死大鼠,腹主动脉采血,ELISA法检测血清胰岛素、肾素、血管紧张素II(Ang II)、醛固酮(ALD);采集胰腺组织,HE染色观察胰岛病理形态改变、检测胰岛微血管数量与密度、胰岛微血管管壁厚度,免疫组织化学法(IHC)检测胰岛α细胞、β细胞数量;TUNEL法检测胰岛细胞凋亡情况;高通量测序法对胰岛微血管进行Affymetrix WT表达谱芯片测序,借助David数据库对差异基因进行GO分析及KEGG通路富集分析;QPCR技术检测胰岛ACE2、IRS-1、AKT1 m RNA表达水平;Western blot技术检测胰岛ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平。结果:1、网络药理学研究结果(1)参芪复方药物配伍后,共计获得152个活性化合物组分,对应278个靶标蛋白;T2DM“疾病-靶点”共计26924个;将“药物—靶点”及“疾病—靶点”进行关联分析后,获得方剂与疾病共同作用靶点共计261个,其中一氧化氮合酶(NOS)家族、蛋白激酶B(AKT)家族是其核心靶点群,与代谢、炎症相关通路等密切相关。(2)“药物—疾病”共同靶点经KEGG通路富集分析,获得参芪复方治疗T2DM的通路共计182条;经文献比对,其中52条通路与T2DM密切相关,包括氧化应激(AGE-RAGE信号通路)、炎症反应(IL-17信号通路、TNF信号通路)、细胞凋亡、胰岛素抵抗等多条信号通路。(3)将上述靶点及通路与文献信息比对,预测参与胰岛微循环的靶标蛋白约35个,包括蛋白激酶B(AKT)家族、基质金属蛋白酶(MMP)家族、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族、肾素血管紧张素系统(ACE2、ANG2、ACE)等。2、实验研究结果(1)一般情况及胰岛病理结果显示:治疗后,中药三组大鼠整体情况较佳,毛色光亮,精神状态良好。M组与G组大鼠在造模后体质量不断下降,但中药三组(SH、SM、SL)大鼠体质量呈先降后升的趋势,与M组及G组比较具有明显差异(p<0.01,p<0.05);造模后各组大鼠摄食量及饮水量均明显增加,与M组比较,中药三组(SH、SM、SL)可在一定程度上减少糖尿病多食、多饮情况(p<0.01)。各组大鼠胰岛病理损伤严重程度依次为:M>SH>G>SM>SL>C。(2)胰岛内分泌细胞及糖调节激素结果显示:与C组比较,造模后各组大鼠胰岛α细胞无明显变化(p>0.05),而β细胞明显减少(p<0.01);治疗后,与M组比较,SL组胰岛β细胞增加(p<0.05);与M组比较,中药三组(SH、SM、SL)均可在一定程度上改善胰岛细胞凋亡(p<0.01,p<0.05);与M组比较,SH组可在一定程度上恢复胰岛素水平(p<0.05)。(3)胰岛微循环各组分结构显示:治疗后,与M组比较,中药三组(SH组、SM组、SL组)大鼠胰岛微血管管壁增厚情况明显改善(p<0.01);与M组比较,SM组胰岛微血管数量增加(p<0.05),SL组、SM组胰岛微血管密度增加(p<0.05)。(4)肾素血管紧张素系统(RAS)激素结果显示:造模后各组大鼠血清肾素(Renin)均明显降低(p>0.05),治疗后未见明显变化(p>0.05);治疗后,与M组比较,中药三组(SH、SM、SL)血管紧张素II(Ang II)显著降低(p<0.01);治疗后,与M组、G组比较,SL组大鼠血清醛固酮水平降低(p<0.05)。(5)胰岛微血管Affymetrix WT表达谱芯片测序及生物信息学分析显示:组间存在基因的显著差异表达:(1)模型组(M)与空白组(C)比较,获得差异基因共183个,其中上调基因59个(32.24%),下调基因124个(67.76%);GO富集获得99个条目,其中生物学过程44条(44.4%),主要涉及胰岛素分泌参与细胞对葡萄糖刺激的反应、G蛋白偶联受体信号通路等;KEGG信号通路富集分析结果共16条,包括淀粉和蔗糖的代谢,肾素-血管紧张素系统,碳水化合物的消化和吸收,代谢途径等。(2)中药组(SL)与模型组(M)比较,差异基因共321个,其中上调基因239个(74.45%),下调基因82个(25.55%);GO富集获得93个条目,其中生物学过程59条(63.4%),主要涉及G蛋白偶联受体信号通路、血管生成、血管形态发生等;KEGG信号通路富集分析结果共9条,包括核糖体,代谢途径等。(3)格华止组(G)与模型组(M)比较,差异基因共301个,其中上调基因183个(60.80%),下调基因118个(39.20%);GO富集获得74个条目,其中生物学过程50条(67.6%),主要涉及钙调节通路等;KEGG信号通路富集分析结果共15条,包括Wnt信号通路,m TOR信号通路,Hippo信号通路等。(6)胰岛微循环关键调控靶点蛋白及m RNA表达情况显示:治疗后,与M组比较,中药组(SL组)ACE2、IRS-1 m RNA表达水平升高(p<0.01,p<0.05),AKT1 m RNA表达水平有升高趋势,但无统计学意义(p>0.05);中药组(SH组、SL组)ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平增高(p<0.01,p<0.05)。结论:1、参芪复方具有“多组分、多靶点、多途径”的作用特点,可通过调节多个靶标蛋白及信号通路起到防治2型糖尿病的作用。2、参芪复方具有改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的功效。参芪复方可在一定程度上改善糖尿病血糖波动大鼠多饮、多食、体重减轻等症状及胰岛病理形态,并且改善胰岛细胞凋亡,恢复糖调节激素水平,降低RAS激素的血管损伤,改善胰岛微血管血供,从而改善胰岛微循环。3、2型糖尿病胰岛微循环障碍具有多基因、多途径的特点,肾素-血管紧张素系统可能是参与胰岛微循环的重要环节,参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的可能机制是通过激活RAS旁路途径(ACE2/Mas轴),促进IRS-1及AKT表达而实现。