基于核酸适配子和DNA芯片的ATP检测研究

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背景:核酸适配子是人工合成的单链寡核苷酸,它能与非核酸靶分子高亲和力和高特异性结合,是从人工构建的寡核苷酸文库中通过体外配体指数级富集系统进化技术筛选出来的,核酸适配子的功能与抗体相似,但与抗体相比,核酸适配子有其独特的优势。运用SELEX技术,至今已筛选出针对不同靶物质的核酸适配子。这些核酸适配子在药物研发,基础医学研究、食品安全卫生、临床治疗、疾病的诊断等诸多领域得到了广泛的应用。目前,在物质检测研究中,核酸适配子的应用不断增多,基于核酸适配子物质检测技术不断更新,它在电化学阻抗光谱、生物传感器、分子信标、微流控细胞分离、流式细胞术、荧光偏振、组织学检查等分析模式中都发挥着重要的作用。目的:将核酸适配子与DNA芯片技术、纳米金标记技术结合,构建一种高灵敏、高特异的ATP检测方法。方法:1.查阅文献获得ATP核酸适配子序列,选取ATP核酸适配子作为诊断识别分子用于ATP的检测;设计与ATP核酸适配子互补的核酸序列作为捕获探针固定到醛基片上。2.建立并优化基于核酸适配子、DNA芯片和纳米金标记技术的ATP检测方法。优化条件包括:捕获探针固定浓度;生物素修饰的ATP核酸适配子与醛基玻片上的捕获探针杂交的时间;ATP与其核酸适配子的反应时间;银染增强时间;ATP与其核酸适配子反应的pH;ATP与其核酸适配子反应的Mg2+离子浓度;3.在优化的条件下,分别对不同浓度的ATP进行检测以测定本方法的灵敏度;分别对ATP、ATP同类和不同类的物质进行检测以测定本方法的特异性。结果:当捕获探针的浓度为0.6μM时固定效率达到最高;在杂交时间为55min,ATP反应时间为45min,ATP与其核酸适配子反应的pH为7.80、Mg2+离子浓度为6mM,银染时间为5.5min时该方法的检测性能达到最佳。通过对不同浓度的ATP样本进行检测,发现该方法在ATP浓度为10-14M到10-9M间时,ATP浓度的对数与灰度值的相对强度呈线性关系,相关系数为0.996。用该方法对TTP、UTP、CTP、GTP、BSA和ATP进行检测,结果证实了本方法能够实现对ATP的高特异的检测。结论:本研究构建的ATP检测方法整合了核酸适配子、DNA芯片和纳米金标记技术,结果证实该方法操作简单、特异性高、灵敏度高。可为其他物质的检测,尤其是对无抗体或抗体制备困难的物质的检测提供新的思路。
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