论文部分内容阅读
[研究目的]皮瓣缺血-再灌注损伤是一系列复杂的病理生理过程。在皮瓣缺血-再灌注时,血管内皮细胞的形态和功能可发生异常,主要表现为内皮细胞代谢障碍、细胞凋亡、各种血管活性物质合成与细胞因子分泌的失调,可导致局部血管阻力增加、毛细血管收缩阻塞,出现“无复流”现象,而无复流又可加重血管内皮细胞的损伤。皮瓣缺血-再灌注时,皮瓣内多种细胞如内皮细胞、炎症细胞皆可大量生成IL-1β,IL-1β又可通过受体配体作用,与IL-1R受体结合,激活下游信号通路,导致核转录因子NF-κB激活,NF-κB入核,在转录水平促进各种炎症介质和生长因子（IL-1,IL-6,TNF-α,VEGF等）的mRNA表达,最终加剧炎症反应,形成恶性循环。TIR/BB环拟似物AS-1是MyD88 TIR/BB结构域的类似物,研究表明AS-1可以抑制IL-1β引起的下游信号转导;小分子化合物TIR/BB环拟似物AS-1可改善心肌缺血-再灌注损伤,其机制与AS-1抑制IL-1β介导的MyD88信号通路激活有关。虽然心肌低氧—复氧损伤的病理生理过程与皮瓣移植低氧—复氧损伤有一定的相似性,但疾病不同,所处的发展阶段不同,组织与细胞不同,同样的药物是否能导致同样的转归和结局值得进一步探讨。尤其是,在皮瓣缺血-再灌注损伤发展进程中,AS-1能否改善血管内皮细胞损伤尚有待阐明。本研究将重点观察AS-1对血管内皮细胞缺氧-复氧损伤的保护作用,并探讨其发挥保护作用的分子机制。[材料与方法]1.实验材料:人脐静脉内皮细胞（H926）。细胞完全培养基采用DMEM,10%胎牛血清,1%的双抗。传代培养5%CO2,37℃培养,细胞密度至80%时传代。2.研究方法2.1实验分组人脐静脉内皮细胞培养72小时后,接种至P35cm细胞培养皿。24小时后更换新鲜无血清培养基,给予AS-1或DMSO预处理2小时。2小时后,给予1%低氧刺激4h,20%常氧刺激。按实验需要继续培养。细胞实验分为四组:（i）空白对照组（control,con.）;（ii）缺氧—复氧处理组（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）;（iii）缺氧—复氧处理组+溶剂对照组（H/R+Vehicle）;（ⅳ）缺氧一复氧处理组+AS-1处理组（H/R+AS-1）。2.2.实验方法:CCK8实验检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞划痕实验检测血管内皮细胞修复能力;real-time PCR检测相关基因表达;western-blot检测相关蛋白表达。[实验结果]为达成实验目的,本研究分为三部分:第一部分:AS-1对血管内皮细胞缺氧-复氧损伤的保护作用不同浓度AS-1对血管内皮细胞存活率的影响血管内皮细胞给予不同浓度AS-1刺激72h,采用CCK8试剂盒检测细胞存活率。发现不同浓度AS-1对血管内皮细胞存活率的影响,没有统计学差异。1.AS-1可以改善缺氧-复氧所致的血管内皮细胞损伤与正常对照组相比,缺氧-复氧可导致血管内皮细胞的存活率明现降低（下降36.7±3.4%）;AS-1能明显改善缺氧—复氧所致的细胞存活率降低（与缺氧-复氧损伤溶剂对照组相比升高16.3±3.9%）。2.AS-1可以减少缺氧—复氧所致的血管内皮细胞凋亡缺氧-复氧能明显促进血管内皮细胞的凋亡（与正常对照组相比升高6.1±1.8%）;AS-1能明显改善缺氧-复氧所致的细胞凋亡（与缺氧-复氧损伤溶剂对照组相比下降3.3±1.4%）。3.AS-1可以改善缺氧-复氧对血管内皮细胞迁移的抑制细胞划痕实验发现,缺氧-复氧刺激能明显抑制体外培养内皮细胞的迁移,细胞修复时间明显延长;而采用AS-1预处理,能明显增强血管内皮细胞的修复功能,溶剂对照组则未见此作用。第二部分:TIR/BB环拟似物AS-1对缺氧-复氧所致血管内皮细胞炎症因子表达的影响1.AS-1可以抑制缺氧-复氧所致细胞炎症因子IL-1的表达缺氧-复氧能明显促进血管内皮细胞合成炎症因子IL-1,与对照组相比增加三倍以上;而细胞在缺氧前给予AS-1预处理,能明显抑制炎症因子IL-1的表达,与溶剂对照组相比下降接近70%。2.AS-1可以抑制缺氧-复氧所致细胞炎症因子TNF-α的表达缺氧-复氧能明显促进血管内皮细胞合成炎症因子TNF-α（与正常对照组相比增加51±7.6%）;而细胞在缺氧前给予AS-1预处理,能明显抑制炎症因子TNF-α的表达（与溶剂对照组相比下降77.9±10.8%）。3.AS-1可以抑制缺氧-复氧所致细胞炎症趋化因子MCP-1的表达缺氧-复氧能明显促进血管内皮细胞合成炎症因子MCP-1,与正常对照组相比增加将近1倍;而细胞在缺氧前给予AS-1预处理,能明显抑制炎症因子MCP-1的表达（与溶剂对照组相比下降60.4±11.6%）。第三部分TIR/BB环拟似物AS-1对缺氧-复氧所致血管内皮细胞功能损伤的调控机制1.AS-1可以抑制缺氧-复氧所致血管内皮细胞P38蛋白的磷酸化缺氧-复氧损伤能明显诱导P38蛋白发生磷酸化修饰,但给予血管内皮细胞AS-1预处理后,能明显抑制缺氧-复氧所致p-P38蛋白的表达上调,而溶剂对照组则没有此作用。2.AS-1可以抑制缺氧-复氧所致血管内皮细胞IκB蛋白的磷酸化与正常对照组相比,缺氧-复氧损伤能明显诱导血管内皮细胞IκB蛋白发生磷酸化修饰,给予AS-1预处理后,能明显抑制缺氧-复氧所致IκB蛋白的磷酸化上调,而溶剂对照组则没有此作用。[结论]TIR/BB环拟似物AS-1可以改善缺氧-复氧所致血管内皮细胞损伤,其机制与AS-1抑制缺氧-复氧所致MAPK、NF-κB信号激活,以及炎症因子表达有关。