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由大丽轮枝菌(Verticillium dahaliae Kleb)引起的的棉花黄萎病是棉花的主要病害,对棉花生产危害极大。该病为土壤传播的真菌病害,防治难度大,目前主要采取选育选用抗病品种为主的综合治理措施。但由于缺乏理想的高抗丰产品种和有效药剂,生物防治日益受到重视。为了寻找生防菌株资源,进而研制开发防治棉花黄萎病的新型生防制剂,本学位论文对棉花黄萎病菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗作用进行了研究,并对筛选获得的拮抗菌XSZ-5的拮抗机制进行了初步探讨。主要结果如下。
1、从安徽各主要棉花种植区采集土样,经室内分离共获得细菌菌株120株,真菌菌株97株。以棉花黄萎病菌菌株HW、WW3为目标菌株,并以生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株为防效对照,经室内初步平皿对峙试验,发现其中有3株真菌菌株ZXC-9、ZZY-3、ZGC1-1和4株细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4、XGC2-9具有很强的抑制作用。在复筛试验中,这3种真菌菌株对棉花黄萎病菌HF菌株的抑制率分别为66.58%、68.30%和76.90%,而4种细菌菌株的抑制作用与枯草芽孢杆菌BS菌株相比无显著差异。杯碟法测定结果表明,其中XSZ-5菌株培养液对病原菌菌株HF和WW3均有较好的抑制效果,抑制率均在70%左右。
2、根据形态特征,参照真菌分类手册,将真菌菌株ZGC1-1和ZZY-3初步鉴定为曲霉属真菌(Aspergillus sp),菌株ZXC-9初步鉴定为青霉属(Penicillium sp)。参照常见细菌鉴定手册,经过对细菌菌株XSZ-5的一系列的形态特征观察和生理生化特征的观察,可以初步确定其为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
3、平板对峙测定表明,拮抗菌株XSZ-5对棉花黄萎病菌(V.dahaliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxyporium f.sp.Vasinfectum)、棉花红腐病菌(F.moniliforme)、水稻稻瘟病菌 (Magnaporthe grisea)、水稻恶苗病菌(F.moniliforme)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(F.graminearum)、玉米穗腐病菌 (F.moniliforme)、油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、烟草赤星病菌 (Alternaria alternata)、草莓灰霉病菌 (Botrytis cinerea)和牡丹根腐病菌 (F.solani)等12种病原菌都具有很好的拮抗效果,对12种病原菌的R值均较小(0.160≤R≤0.544),其中以对棉花红腐病菌的R值为最小(0.160)、对棉花黄萎病菌的R值为0.264。该菌株抑菌谱较广,具有较大开发应用价值。
4、在离体条件下,拮抗菌株XSZ-5活菌液对棉花黄萎病菌的抑制效果最好,在1:10、1:100、1:500时的抑制率分别是98%、87.5%、69%,高温灭菌液和滤液的抑菌作用相对较差。高温灭菌液对棉花黄萎病菌抑菌效果显著,说明拮抗菌株XSZ-5的抗菌物质具有一定的高温稳定性。三者随着稀释比例的加大,抑制率都有所下降。
5、应用弱极性有机溶剂氯仿、乙醚、乙酸乙酯从发酵液中萃取到的物质对棉花黄萎病菌没有抑菌活性,而水性部分有较高的抑菌活性。由强极性有机溶剂丙酮萃取到的物质具有一定的抑菌活性,其剩余水性部分仍具有一定的活性。其结果说明,由XSZ-5所产生的抑菌物质不能被弱极性有机溶剂萃取而能被强极性的有机溶剂萃取。
6、硫酸铵沉淀能抑制孢子萌发和菌丝生长,因此初步确定了芽孢杆菌XSZ-5菌体的抑菌物质的性质为多肽类的抗菌物质。在硫酸铵饱和度为70%的时候,抑菌活性达到最大,因此可以选择此饱和度作为以后提取有效物质的饱和度。
7、将XSZ-5菌株接摇瓶于30℃振荡培养,测定其培养不同时间后的含菌量,绘制生长曲线。从曲线可以看出,培养0~6h,拮抗菌XSZ-5的菌量急剧增加,6~12h缓慢增加,12h后菌量趋于稳定。该菌株在24~48h开始产生芽孢囊,48~72h成熟芽孢形成,72h芽孢形成的同步率为80%~90%。