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细胞凋亡是细胞受一系列基因调控的有序的自主性死亡方式,是主动的、程序性的清除不需要的、损伤的或有害细胞的生物学过程。细胞凋亡在昆虫变态与发育中扮演着重要作用,也是一种昆虫抗病毒免疫应答形式。家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫遴选的模式昆虫,属于完全变态昆虫,经卵、幼虫、蛹和成虫(蛾)四个发育阶段完成其生命周期,在这一生命过程中伴随着器官的重塑与组织更新,细胞凋亡在此变态发育中具有重要作用。本研究对家蚕细胞凋亡相关基因BmICE-2进行了克隆及功能鉴定分析,这将为家蚕细胞凋亡及其调控机制研究奠定基础,同时为鳞翅目昆虫的病虫害防治提供理论依据。主要研究结果如下：1.BmICE-2基因的克隆及其分子特征本研究采用RT-PCR方法,选取家蚕细胞系BmN-SWU1及五龄家蚕大造(p50)中肠组织,对BmICE-2基因进行了克隆及分子特征分析。BmICE-2基因ORF编码284个氨基酸,预测分子量为32720Da；应用InterProScan v.4.8在线预测分析表明,BmICE-2多肽含有Caspase特征性的QACRG五肽序列,一个较短的N一端前功能结构域(1-51AA残基),一个P20的大亚基(52-173AA残基),一个Caspase Linker结构域(174-189AA残基)和一个P10小亚基(190-284),QACRG的五肽序列中具有催化裂解活性的半胱氨酸(171C)。通过对BmICE-2蛋白的Phyre2同源建模及序列比对,发现BmICE-2蛋白具有Caspase典型特征,并同Sf-caspase-1的3D结构模型功能域蛋白的序列相似性为87%,模型可信度为100%,并且其Caspase活化的P1位点高度相似,都为Caspase Asp活化位点。2.BmICE-2mRNA表达分析及凋亡诱导通过QRT-PCR分析家蚕大造(P50)五龄幼虫至蛹期中肠组织中BmICE-2基因mRNA转录水平,发现BmICE-2mRNA在五龄幼虫、熟蚕、蛹变态发育期的表达量呈波动变化：在五龄一天至五龄五天呈下降趋势,五龄五天至蛹期第一天呈上升趋势；从蛹期第一天至蛹期第二天呈明显下降趋势。在家蚕BmN-SWU1细胞系中BmICE-2mRNA表达明显高于BmICE基因的mRNA表达量。通过QRT-PCR分析蜕皮激素20E处理后不同时间点中肠组织中BmICE-2基因]mRNA表达水平,发现20E注射后12h至48h, BmICE-2基因mRNA表达量明显上调,表明BmICE-2基因的表达可能受到蜕皮激素的调节。放线菌素D和重组BmNPV病毒(vBmPH-EGFP)诱导家蚕BmN-SWU1细胞,进行QRT-PCR分析BmICE-2基因的mRNA表达水平,发现在放线菌素D诱导12h后BmICE-2基因的mRNA表达水平上调10倍以上,诱导24h后上调近40倍；而vBmPH-EGFP侵染也能诱导BmICE-2基因的mRNA上调表达。通过Hoechst33258染色发现,以150ng/mL放线菌素D诱导BmN-SWU1细胞,12h、24h和36h后进行Hotechst33258染色并用荧光显微镜观察,发现诱导组细胞随着时间的延长,细胞核的凋亡特征越来越明显,而Caspase抑制剂和DMSO的对照组细胞的细胞核没有出现凋亡特征。在放线菌素D诱导的家蚕BmN-SWU1细胞凋亡进程中,BmICE-2基因的：mRNA表达显著上调,其可能参与放线菌素D诱导的家蚕BmN-SWU1细胞凋亡并执行相应的功能。3、BmICE-2蛋白的Caspase活性鉴定及其促凋亡特征为了检测家蚕组织和细胞内BmICE-2蛋白,应用原核表达的BmICE-2可溶性上清蛋白制备了鼠多克隆抗体,同时以家蚕BmICE-2的氨基酸序列(N’-CTYTPKCQETNNK-C’,255-266)多肽为抗原,免疫实验用新西兰大白兔制备多肽抗体。通过免疫印迹及Caspase酶活性检测分析,表明原核表达的BmICE-2可溶性上清蛋白具有Caspase自身裂解活化特征和哺乳动物Caspase-9Ac-LEHD-pNA底物特异性；瞬时表达的BmICE-2蛋白在家蚕细胞和草地贪夜蛾细胞中均能产生自我剪切活化,并能激发家蚕BmN-SWU1细胞中Caspase-9(Ac-LEHD-pNA)和Caspase-3(Ac-DEVD-pNA)活性；免疫荧光试验及Hotechst33258染色观察,发现瞬时表达BmICE-2蛋白的细胞中核纤层蛋白被破坏而弥散于细胞质,细胞核具有明显的凋亡特征,而在家蚕BmN-SWU1细胞中共表达BmICE-2和BmIAP,免疫荧光及免疫印迹实验表明,BmICE-2和BmIAP共表达的细胞中细胞核没有明显的凋亡特征,BmIAP和BmICE-2存在相互作用,BmIAP能抑制BmICE-2激发的家蚕细胞凋亡。放线菌素D诱导的家蚕BmN-SWU1细胞凋亡进程中,应用QRT-PCR分析BmICE-2和BmIAP基因mRNA表达水平,发现BmICE-2基因上调表达而BmIAP基因则下调10倍以上；Western blot结果表明,放线菌素D诱导家蚕BmN-SWU1细胞中内源性BmICE-2蛋白发生了自身裂解活化而产生Caspase小亚基P10。以上结果表明,在家蚕细胞中瞬时表达BmICE-2蛋白能激发Ac-LEHD-pNA底物水解活性,并能激发Caspase-3蛋白酶活性及伴随着BmICE-2蛋白的水解活化而引致细胞凋亡的发生,但是在Sf9细胞中不能激发细胞凋亡的发生；在放线菌素D诱导下,内源性的BmICE-2蛋白发生了自身水解活化；BmIAP能抑制BmICE-2所激发的细胞凋亡,可见BmICE-2基因可能是家蚕一个新的促凋亡基因而参与家蚕细胞凋亡进程。4、BmICE-2蛋白活化位点与家蚕细胞内核质转位分析通过定点突变BmICE-2蛋白氨基酸残基中D177和D185位天冬氨酸突变为丙氨酸(A),对D177和D185位氨基酸突变后进行原核表达的BmICE-2-D177A-His和BmICE-2-D185A-His可溶性蛋白,没有Caspase-9活性及蛋白裂解活性；瞬时表达的BmICE-2-D177A-dsRed和BmICE-2-D185A-dsRed蛋白不能激发家蚕BmN-SWU1细胞Caspase-9和Caspase-3活性,Hoechst33258染色分析也没有发现凋亡特征的细胞核,可见BmICE-2蛋白氨基酸残基中D177和D185为BmICE-2蛋白Caspase裂解活化的P1位点。通过免疫荧光及免疫印迹试验表明,内源性的BmICE-2蛋白在家蚕细胞中呈集聚状态分布于细胞核,具有典型的Caspase酶原特征；在凋亡刺激下,积聚于核内的BmICE-2蛋白呈散点状分布而活化,发生核质转位而弥散于细胞质中,内源性的BmICE-2蛋白在细胞内的定位及转位特征也类似于哺乳动物凋亡Caspase特征。在放线菌素D诱导的家蚕细胞凋亡中,部分BmICE-2蛋白转位于结构被破坏的线粒体上,可见BmICE-2蛋白活化与线粒体结构的破坏与改变有关,线粒体可能参与家蚕放线菌素D诱导的细胞凋亡。