论文部分内容阅读
本文主要研究微生物sp.G3g菌产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的分离纯化和真菌中RNA的提取.实验结果表明:sp.G3g菌产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的最佳诱导物为人参,最佳浓度为4％;最佳发酵时间为120小时;用硫酸铵沉淀人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的最佳硫酸铵饱和度为85％.选用0.025M pH7.2 Tris-Hcl缓冲体系下的DEAE-Cellulose DE52分离提纯人参皂苷-α-鼠李糖苷酶,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定结果为单-的单点,酶蛋白分子量约为56kDa.人参皂苷-α-鼠李糖苷酶在提纯过程中的收率为2.9％;比活力由发酵粗酶液的14.1 U/mg上升为65.6U/mg,提高了4.6倍.对sp.G3g菌所产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶做蛋白质电印迹以及蛋白质N-端序列测定,N-端1 6个氨基酸残基依次为Ser-Thr-Pro-Ala-Asp-Asn-Val-Ser-Gln-Ser-Ile-Tyr-Asn-Gln-Asn-Thr,测序结果提取的酶蛋白纯度在97％以上.以这16个氨基酸残基为基础,在国际互联网蛋白质序列数据库中作蛋白质同源性比较,发现与蛋白质数据库中已知的蛋白质没有同源性.sp.G3g菌所产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的最适反应条件的研究表明:酶反应的最佳底物浓度为1.0mg/ml,最佳酶反应时间为18小时,最适温度为40℃,最适pH值为5.0.对人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的底物水解能力进行的研究表明:提纯酶只水解人参皂苷-α-鼠李糖苷键,酶活力为46.5 U/ml,对pNPR和芦丁的酶反应活性都很低,分别为1.0U/ml和0.8 U/ml.说明人参皂苷-α-鼠李糖苷酶具有水解人参皂苷Re的C-6位末端上的α-鼠李糖苷键的酶专一性,是专一性酶.本文采用异硫氰酸胍和Catrimox-14TM联合变性,酚、氯仿、异戊醇多次抽提,用异丙醇沉淀RNA,得到了高质量、完整的RNA.提取的RNA OD<,260>/OD<,230>=2.16,OD<,260>/OD<,280>=1.82,纯度较好,无杂质污染,均一性比较好.在1g菌丝体中得到的总RNA为1.8mg,得率为0.18％.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳28S RNA条带的亮度接近18S RNA条带亮度的2倍,表明总RNA分子完整,降解较少.