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多溴联苯醚(Polybrominated biphenyls ethers,PBDEs)山于具有良好的阻燃性质,广泛应用于塑料、电子、建筑、纺织等材料与产品中,是世界上消费量最大的一类是溴代阻燃剂。它们和PCBs等具有相似的结构和性质,例如具有强亲脂疏水性,在环境中难于降解,滞留时间长,许多类似于二思英的致毒机制已经被发现。目前,PBDEs已成为一类近年来受到广泛关注的新型持久性有机污染物,对其环境问题的研究已成为当前环境科学的一大热点。南方某电子垃圾处理地河流中持久性有机污染物溴代阻燃剂(brominated flame retardants,BFRs)、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)、多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),重金属(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn)等污染物严重超标。生活在这种严重污染环境下的微生物必然有特殊的生理代谢机制和群落结构特点。然而目前学者们对该污染环境的微生物群落结构特征的研究还很少,本论文研究首次采用分子技术对未污染水库、污染河流练江及用十溴联苯醚分别富集一个月和两个月的练江底泥中细菌群落结构进行研究。
本文采用了扩增的rDNA限制酶切分析(ARDRA)和16S rRNA基因文库分析的方法对上述四种沉积物样品进行细菌群落结构的研究。利用分子生物学的方法来研究微生物生态,样品总DNA质量起着十分重要的作用。其中包括:一DNA量的多少、二DNA的完整性、三所提DNA是否能代表微生物的种群多样性。然而,不同环境的沉积物或土壤样品成分差异大,加上黏土对DNA的吸附,抽提过程中DNA的降解与损失,酶类抑制剂等杂质的共提取及纯化效率的高低都会影响后续实验的开展。本实验样品因其污染十分严重,底泥中腐殖质、重金属等一些酶类抑制剂杂质较多,严重影响了其DNA的提取。本研究发现利用改进SDS-酚氯仿抽提法提取DNA效率较高,且能够满足后续研究需求。
利用提取纯化的样品总DNA为模板,扩增了细菌的16SrDNA片段,并构建了相应文库。通过对文库克隆子的ARDRA分析,探讨了文库OTU多样性,结果表明:未污染水库底泥中细菌群落组成主要包括变形细菌门(Proteobacteria)的α、β、γ和δ4个亚门、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和厚壁菌门(Firmicutes)。优势菌是酸杆菌,占文库克隆的30.2％。污染河流底泥中细菌群落组成包括变形细菌门(Proteobacteria)的α、β、δ和ε4个亚门、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、待定菌群candidate division OP01、candidate JJvision OP08和candidate division WS3的相似菌。优势菌是ε-变形细菌和绿弯菌,占文库克隆的44.9％。十溴联苯醚富集一个月的练江底泥中细菌群落组成主要包括变形细菌门(Proteobacteria)的α、β和γ3个亚门、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)。优势菌为β-变形菌(β-Proteobacteria)占克隆文库的34.1％。富集两个月的细菌群落组成包括变形细菌门(Proteobacteria)的α、β、δ和γ4个亚门、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。优势菌为α-变形细菌门(α-Proteobacteria)占克隆文库的50％。
对不同环境下的四种沉积物样品的细菌多样性比较分析发现:未经富集的水库和练江底泥中细菌多样性较丰富,但是种类差异较大,具有不同的优势菌,且各种群在数量上也各不相同；二者样品在GenBank中得到100个对应序列,91个属于通过分子生物学手段得到的不可培养的细菌的序列；与已知序列同源性相比低于95％的43个。经过富集后的两个样品中细菌群落结构比较相似,在GenBank中得到82个对应序列,28个属于不可培养的细菌的序列,54个可培养序列；与已知序列同源性相比低于95％的分别为8个和9个。与未富集的样品相比细菌的多样性丰富度发生较大变化门类变少了,门内的细菌的多样性更丰富了；优势菌变为α-变形细菌亚门和β-变形菌亚门,可培养菌比例增大。这些都表明,不同污染物质可以抑制或促进某一种细菌的生长,从而对细菌群落结构产生影响。对探讨溴代阻燃剂污染对底泥中细菌群落结构的影响,及全面理解污染底泥中微生态网络结构与系统功能、制定溴代阻燃剂降解菌的筛选分离策略,进而开发高效的溴代阻燃剂降解工程菌具有重要意义。