论文部分内容阅读
沙门氏菌是人和各种动物的传染性病原因子。肠炎沙门氏菌属于无宿主特异性而有侵害性的革兰氏阴性杆菌，可由人传给动物也可由动物传给人，即所谓“人畜共患病原体”。
沙门氏菌的防治除加强管理外，主要采用药物防治和疫苗预防。利用商品化肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis，SE)菌苗作为疫苗是用来作为控制SE污染的一种方法。然而，SE菌苗存在的内毒素可能会对鸡产生潜在的危害。研究表明，SE鞭毛抗原作为疫苗具有巨大的潜能。SE鞭毛抗原有很多组分，最主要的成分是FliC抗原，而FliC抗原最主要的抗原位点是g.m.位点，也称为SEp9。SEp9作为一个亚单位抗原，在鸡感染SE后的连续免疫反应和抗原递呈中都具有重要作用。
本论文的内容分为以下3个部分：
1.载体构建从NCBI数据库查到SEp9编码的基因序列，SEp9基因共279bp，共编码93个氨基酸。全基因合成后进行酶切、连接，构建pVAXl-SEp9重组质粒。利用引物设计软件Priemr 5.0设计引物Cl、C2、C3、C4，PCR搭桥合成104bp含有9个CpG基序的寡聚核苷酸序列，连接到pVAXl-SEp9重组质粒非编码区，构建成pVAXl-SEp9-CpG重组质粒。同时，将SEp9序列连接到pET-28a(+)载体中，构建pET-28a(+)-SEp9原核表达载体，通过BL21(DE3)溶原菌有效地进行表达。
2.体外细胞试验用于试验的核酸疫苗在进行体内实验前必须首先证明能在体外哺乳动物细胞中表达。目前较多采用在适当的细胞系中进行短暂表达。为了检测构建的DNA疫苗质粒pVAXl-SEp9和pVAXl-SEp9-CpG所克隆基因的表达情况，将正确构建的重组质粒纯化后，用脂质体法转染COS7细胞，并用PBS作为阴性对照，通过RT-PCR检测了pVAXl-SEp9和pVAXl-SEp9-CpG重组质粒的表达情况，结果显示两重组质粒中SEp9都扩增出约300bp大小泳带，而阴性对照则无扩增产物，说明pVAXl-SEp9和pVAXl-SEp9-CpG重组质粒中的SEp9在COS7细胞内都获得了表达。
3.动物试验 研究重组质粒 DNA疫苗对SE的抑菌效率，同时应用prime-boost免疫策略，设立PBS对照组、pVAX1质粒组、pVAXl-SEp9质粒组、pVAXl-SEp9-CpG质粒组、pVAXI-SEp9+SEp9蛋白混合组、pVAX l-SEp9-CpG+SEp9蛋白混合组、SEp9蛋白组、SE疫苗组。后腿股四头肌注射健康BALB/c雌性小鼠，每周用摘眼法采血后处死，无菌收集小鼠盲肠组织。用ELISA方法检测小鼠外周血液中特异性IgG抗体，实时荧光定量PCR检测小鼠肠组织MCP-1的表达，流式细胞术分析小鼠外周血液中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的百分含量的变化。免疫后的第6周用SE进行攻毒实验。结果显示除PBS对照组和pVAX1质粒组外，各试验组均能不同程度地刺激小鼠产生SEp9特异性IgG抗体，诱导肠道MCP-1的表达，引起CD4+、CD8+淋巴细胞亚群含量的增加。SE攻毒后，除对照组外，各试验组对SE菌的抑制都不同程度的下降。SEp9蛋白组最好，为46.5％；pVAXl-SEp9-CpG+SEp9蛋白混合组和pVAXl-SEp9+SEp9蛋白混合组较SEp9蛋白组低，分别为22.5％和22％；pVAXl-SEp9-CpG质粒组和pVAXl-SEp9质粒组则较差，分别为15.3％和9.2％。动物免疫研究证明构建表达的DNA疫苗能增加机体特异性免疫应答，提高小鼠对肠炎沙门氏菌感染的保护率，为这类亚单位抗原DNA疫苗应用与开发奠定了理论基础。