【摘 要】
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目的:RNA结合蛋白IGF2BP3被报道在多种肿瘤中异常表达,并能通过m6A调节的方式影响肿瘤细胞的命运。本课题通过免疫组化技术,细胞分子实验结合RNA测序和RNA甲基化测序研究IGF2BP3在膀胱癌中的作用和初步机制。方法:（1）利用TCGA膀胱癌基因表达数据和生存数据筛选出m6A相关的RNA结合蛋白IGF2BP3;利用免疫组化和q RT-PCR检测IGF2BP3在组织中的表达水平。（2）应用C
【基金项目】
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广西基因组与个体化医学研究重点实验室:广西重点实验室运行补助项目,项目编号:19-185-33、19-050-22、17-259-45; 广西基因组与个体化医学研究协同创新中心:广西高校科技创新和服务能力提升工程项目,项目编号:桂教科研[2020]8号文; 广西自然科学基金创新团队:肝癌的三维基因组学,项目编号:2016GXNSFGA380006; 广西科技开发项目:广西区域高发肿瘤肝癌基因检测新
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目的:RNA结合蛋白IGF2BP3被报道在多种肿瘤中异常表达,并能通过m6A调节的方式影响肿瘤细胞的命运。本课题通过免疫组化技术,细胞分子实验结合RNA测序和RNA甲基化测序研究IGF2BP3在膀胱癌中的作用和初步机制。方法:（1）利用TCGA膀胱癌基因表达数据和生存数据筛选出m6A相关的RNA结合蛋白IGF2BP3;利用免疫组化和q RT-PCR检测IGF2BP3在组织中的表达水平。（2）应用CRISPR/CAS9基因编辑技术构建敲除IGF2BP3的T24稳定细胞系,并用DNA测序和蛋白免疫印迹技术验证敲除效果。在T24和T24敲除IGF2BP3细胞系应用MTT实验,平板克隆形成,流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验,Transwell侵袭实验检测细胞生物学功能的变化。（3）提取临床膀胱癌样本组织的RNA并测序,分析IGF2BP3在膀胱癌中的作用;同时利用RNA-seq和MeRIP-seq,联合分析敲除IGF2BP3后细胞基因表达和m6A水平的变化,探讨IGF2BP3在膀胱癌中的作用及初步机制。结果:（1）TCGA数据分析结果提示IGF2BP3在膀胱癌中比正常组织高（P<0.05）,高表达IGF2BP3的患者生存时间更短（P<0.01）;免疫组化实验显示IGF2BP3在膀胱癌组织的阳性率为44.4%（32/72）,在正常膀胱组织中不表达（0/12）,两组阳性率的差异具有统计学意义（P<0.01）;免疫组化提示IGF2BP3表达与淋巴结转移、肿瘤浸润性相关（P<0.05）;q RTPCR和Western Blot实验检测到IGF2BP3在T24、5637、J82、SW780细胞不同程度的表达。（2）成功应用CRISPR/CAS9基因编辑技术构建了敲除IGF2BP3的T24细胞系。（3）敲除IGF2BP3后,MTT实验,平板克隆形成实验显示T24细胞的生长增殖能力下降;流式细胞术检测到敲除IGF2BP3后细胞凋亡增加（P<0.05）;划痕实验和Transwell侵袭实验显示细胞迁移和侵袭能力无明显变化。（4）提取对膀胱癌组织RNA进行测序并分析,结果提示增殖相关基因的表达变化与IGF2BP3相关,在IGF2BP3表达高的标本,增殖相关基因的表达也高;应用GO和KEGG分析T24和T24-KO差异基因和m6A相关差异基因,GO分析结果提示差异基因主要富集在细胞外基质相关的通路上,KEGG分析结果提示差异基因主要富集在TNF signaling pathway;GO分析m6A相关的差异基因主要与基因的转录调控相关,KEGG分析m6A相关的差异基因主要富集在Hippo signaling pathway;联合转录水平和m6A水平的差异基因分析,提示与细胞生长增殖有关的差异基因:SPHK1,POMT2,MRPS18A。结论:（1）IGF2BP3在膀胱癌组织异常高表达;IGF2BP3与肿瘤的转移,浸润性相关。（2）IGF2BP3在膀胱癌组织的表达与细胞增殖基因相关。（3）IGF2BP3影响T24细胞的生长增殖、凋亡。（4）SPHK1,POMT2,MRPS18A可能是IGF2BP3的靶标,但还需进一步的验证。
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