论文部分内容阅读
甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物,具有重要的生理活性,在临床上有广泛的应用。许多分枝杆菌可以使用低附加值的甾醇作为碳源和能源来生产甾体激素药物成分或前体,因此,修饰或改造分枝杆菌代谢途径以积累高附加值甾体中间体是甾体制药工业半合成路线中最重要的一步。甾醇氧化过程在分枝杆菌中高度保守,通过对甾体多环或侧链的一些生物转化,可以得到许多有价值的药物中间体,如C19类固醇雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）以及C22类固醇20-羟甲基孕甾-4-烯-3-酮（4-HBC）。本论文利用一系列基因编辑技术改造实验室现有菌种,获得可以大量积累AD和9α-OH-AD的工程菌。首先利用CRISPR-dCas9构建了抑制Mn-AD中hsd4A表达的菌株,同时抑制Mycobacterium neoaurum 2967（M.neoaurum 2967）中hsd4A 和kstD表达的菌株,以及利用CRISPR-Cas12a构建了耻垢分枝杆菌mc2155（M.smegmatis mc2155）中kstD1的失活菌株。首次为本实验室引入CRISPR-dCas9基因抑制方法及CRISPR-Cas12a基因失活方法,弥补了同源重组编辑方法的劣势。应用新引进的基因编辑方法,本课题主要开展了两个方面的工作:首先,以kstD1（MSMEG5941）、kstD2（MSMEG2869）和kstD3（MSMEG2867）为研究对象,探究了M.smegmatis mc2155菌株中这3个基因所编码的 3-甾酮-△1-脱氢酶（3-ketosteroid-△1-dehydrogrnases,KstDs）的活力。其次,利用CRISPR-Cas12a依次失活kstD1、kstD2、kstD3,构建了 Msm1、Msm13和Msm123菌株,其中Msm1可积累主产物9α-OH-AD。9α-OH-AD在Msm123菌株中可稳定积累,不再降解,该菌株以5 g/L植物甾醇为底物培养14天时,9α-OH-AD的产量能达到2.86 g/L,底物转化率较Msm1增加15%左右。同时揭示了 3个KstD在9α-OH-AD药物中间体的产生及稳定性积累方面的作用。另外,分枝菌酸是分枝杆菌细胞膜的主要脂质成分,以分枝菌酸合成过程中的关键酶,β-酮酰基-ACP合成酶KasAB和3类SAM依赖型甲基转移酶为靶点,利用CRISPR-dCas9抑制相关基因的表达或直接敲除该基因,构建了一系列工程菌株,用高效液相色谱法分析所有工程菌株代谢植物甾醇的主产物产量,同时提取分枝菌酸并进行TLC检测,与对照菌株Mn-AD或Msm1进行比较。本次研究结果标明,部分抑制或完全敲除这些基因对植物甾醇的生物转化及分枝菌酸的合成影响不大。本论文首次为实验室引入了 CRISPR基因编辑技术,之后利用相关技术在Mn-AD及M.smegmatis mc2155中构建了一系列工程菌株,得到了培养14天内9α-OH-AD能够稳定存在,且底物质量转化率达到57.2%左右的菌株Msm123,同时探究了分枝菌酸合成过程中的关键基因对植物甾醇转化的影响。