血吸虫病(schistosomiasis)是全球第二大严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,目前全世界血吸虫病感染人口约有2亿人。我国流行的是日本血吸虫病(schistosomiasis japonica),虽然经过多年的防治,血吸虫病的流行率已大大降低,但目前仍是主要的公共卫生问题之一。日本血吸虫病的主要病理损伤是急性期的虫卵沉积所致的肝、肠虫卵肉芽肿反应以及发展到慢性期的肝纤维化。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)作为产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞,其激活是肝纤维化发生、发展中的关键环节。近年来已有不少关于血吸虫病发病机制的研究,但未见有研究系统观察日本血吸虫病发展进程中HSCs的基因表达谱动态变化特征。吡喹酮以其疗效好、毒性低、代谢快和安全性高等优点而成为治疗血吸虫病的首选药物,经杀虫治疗后可部分逆转肝纤维化。但是,肝纤维化形成过程是多因素参与、多步骤改变的过程,对其发生、发展中众多的参与基因的了解知之甚少,部分制约了抗纤维化药物的研发。因此,目前尚无很好的预防和治疗肝纤维化的措施和手段。本研究拟通过建立日本血吸虫感染小鼠模型,分离原代HSCs,应用基因表达谱芯片检测技术和生物信息学分析方法,探讨日本血吸虫病发生、发展过程中HSCs的基因表达谱动态特征及相关分子机制,以及吡喹酮杀虫治疗对感染慢性期小鼠HSCs基因表达谱的影响,以期筛选出影响血吸虫病肝纤维化转归的起关键作用的因子,作为血吸虫病肝纤维化治疗的潜在靶点。为此,本文进行了以下三个主要部分的研究：一、动态观察和分析日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞基因表达谱特征为了在基因水平上探讨血吸虫病致病机制,我们建立了日本血吸虫感染小鼠模型,选取小鼠在感染进程中的5个特定时期作为研究实验点,分别为未感染时(正常对照)、感染后3周(成虫产卵前)、感染后6周(急性期)、感染后12周(慢性期)和感染后18周(慢性后期)。通过酶灌注法和密度梯度离心法分离出小鼠HSCs,应用高通量的基因芯片技术检测各个时段肝HSCs的基因表达谱特征；并运用生物信息学分析方法对疾病进程中显著变化的差异基因进行基因功能分类和通路分析。结果显示,原代分离小鼠HSCs纯度达到90%,细胞存活率为95%以上。基因表达谱芯片检测发现,在血吸虫感染进程中共有6762个差异表达基因。根据基因共表达趋势分析提示,有22种显著性的基因表达趋势,其中最为显著(P<0.001)的4种趋势分别为：①感染后3周表达上调后持续高表达；②感染3周表达有所上调而急性期和慢性期表达则持续在更高水平；③急性期表达上调并在慢性期持续高表达；④在感染后3周表达下调后持续低表达。对这4类基因功能注释和通路分析发现,它们主要参与调节凋亡、免疫应答、胶原代谢过程、MAPK信号通路和VEGF信号通路等等。这4类表达趋势中的基因在感染后不同阶段的表达均不同于正常状态,而在每个阶段它们相互作用构成了复杂的基因调控网络。这些关键基因可能在血吸虫成虫产卵期、感染急性期和慢性期的进程中的各个不同阶段可能起到不同的调节作用。二、吡喹酮杀虫治疗对感染慢性期小鼠HSCs基因表达谱的影响尽管在努力揭开肝纤维化发生、发展的相关分子机制的面纱,但肝纤维化的病因多样性致使对导致肝纤维化发生的关键分子改变并不完全了解,仍有许多问题尚未解决。因此,我们建立了日本血吸虫感染6周后的小鼠模型,给予传统的吡喹酮杀虫治疗(250mg/kg/天,连续3天),以探讨吡喹酮杀虫治疗对日本血吸虫感染小鼠HSCs基因表达谱的影响,并进一步探讨血吸虫病肝纤维化转归的分子机制。首先,建立了日本血吸虫感染慢性期(感染后12周)和吡喹酮治疗(感染后6周时进行杀虫治疗3天至感染后12周)的小鼠模型,并以同期正常小鼠为对照。通过酶灌注法和密度梯度离心法分离出小鼠肝HSCs,应用基因芯片技术检测肝脏HSCs的基因表达谱,再通过生物信息学分析方法对吡喹酮治疗引起表达显著变化的基因进行基因功能分类,并运用Pathway Studio软件构建细胞过程调控网络和基因间相互作用网络,找出吡喹酮治疗在血吸虫病肝纤维化转归中可能起关键作用的基因,并采用实时定量PCR检测部分差异表达基因的转录水平。结果筛选出1075个差异基因,它们主要参与调节14个生物学过程(p<0.05)。其中基因参与数目最多的是"Immunity and defense"(免疫和防御),共有132个基因参与调节此功能。另外,诸如Cell adhesion (细胞粘附)、Cytokine/chemokine mediated immunity(细胞因子／趋化因子介导的免疫)、Apoptosis(凋亡)、Cell communication(细胞交流)、Cell motility(细胞能动性)和Extracellular matrix protein-mediated signaling(细胞外基质蛋白介导的信号通路)等也被显著调节。因此,血吸虫感染引起HSCs的基因表达谱显著变化,而吡喹酮治疗可逆转其中部分基因的变化趋势,这些基因参与调节的主要生物学过程与HSCs活化、迁移、细胞形态改变和凋亡等密切相关。最令我们感兴趣的是,VEGF和IL-6与其它差异基因间的相互作用关系最为复杂,在基因间的调控网络中处于中心地位,它们在血吸虫病肝纤维化发生和转归中可能起到关键作用。三、VEGF在日本血吸虫病肝纤维化中意义的初步研究通过基因表达谱芯片检测发现,血管内皮生长因子(VEGF)在感染慢性期表达显著上调,而吡喹酮治疗则逆转其变化趋势。生物信息学分析进一步提示,在吡喹酮治疗所逆转表达变化趋势的众多基因中,VEGF作为最关键的因子之一,与其它基因间作用关系尤为复杂,并参与调节细胞迁移、趋化性、成纤维细胞增殖以及细胞形态的调节等。VEGF极有可能参与血吸虫病引起的虫卵肉芽肿和肝纤维化的发生、发展,值得作进一步研究。为了探讨VEGF对血吸虫病病程进展所发挥的作用及其分子机制,我们建立了血吸虫感染模型并应用吡喹酮治疗,检测VEGF在肝脏组织中的表达情况,观察吡喹酮对血吸虫感染小鼠HSCs表达VEGF的影响：同时,进行一系列体外试验以观察日本血吸虫可溶性成虫抗原(soluble adult worm antigen, SWAP)和可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen, SEA)对人HSCs细胞系LX-2的作用以及对人脐带静脉内皮细胞系(HUVEC)表达VEGF的影响和对细胞增殖的作用,以及观察VEGF对LX-2的活化、增殖和产生胶原的影响等,以探讨旁分泌VEGF对HSCs的作用及其机制,为进一步研究VEGF在血吸虫感染引起肝纤维化病变中的调控作用,并为以VEGF作为靶点的生物治疗提供实验依据。结果显示,感染组小鼠肝脏VEGF阳性细胞数量较正常组明显增多,而吡喹酮治疗组小鼠肝脏VEGF阳性细胞数量则显著低于感染组,提示毗喹酮治疗抑制血吸虫感染小鼠慢性期肝脏VEGF的表达。我们还发现,a-SMA和VEGF双阳性细胞数量在感染组显著高于正常组,而吡喹酮治疗组则显著低于感染组,提示吡喹酮治疗不仅抑制了肝脏整体的VEGF水平,而且也抑制了HSCs表达VEGF水平。SWAP和SEA在体外抑制HSCs的活化水平及其产生胶原的能力,这与我们前面所述的感染小鼠中HSCs活化水平升高、产生胶原增多并不一致,而且SWAP和SEA刺激LX-2表达VEGF水平上升的变化强度也不及感染小鼠体内HSCs,这提示,虫源性抗原在体内可能并不是直接活化HSCs,并使其产生胶原和VEGF表达增加。也提示我们,感染小鼠肝脏中VEGF增多可能并不是由于虫源性抗原SWAP和／或SEA对HSCs的直接作用。内皮细胞是主要产生VEGF的细胞之一,因此,我们建立了人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)的培养体系,分别用real-time PCR和ELISA检测不同浓度SWAP/SEA刺激HUVEC后,其VEGF转录水平以及培养上清中VEGF蛋白水平。当SWAP浓度达到20μg/mL时可显著增加HUVEC培养上清中VEGF水平(P<0.001),且呈剂量依赖关系。SEA则在浓度为10μg/mL时就可显著刺激HUVEC培养上清中VEGF水平的增加(P<0.001),且呈剂量依赖关系。在相同抗原浓度时,SEA刺激HUVEC培养上清中VEGF增加的作用更强。SWAP和SEA对HUVEC表达VEGF转录水平的影响与蛋白水平上的基本一致。VEGF刺激LX-2后,其a-SMA和Col1a1的mRNA转录水平均显著增高,提示VEGF可刺激HSCs活化并使其产生I型胶原水平增加；10ng/mLVEGF可显著刺激LX-2增殖。本研究获得的主要结果：1.原代分离小鼠HSCs纯度为90%以上,细胞存活率为95%以上,达到相关实验的要求,保证了后续实验的顺利进行。2.基因表达谱芯片检测发现,在血吸虫感染进程中共有6762个差异表达基因。根据基因共表达趋势分析提示,有22种显著性的基因表达趋势,其中最为显著(P<0.001)的4种趋势分别为：①感染后3周表达上调后持续高表达；②感染3周表达有所上调而急性期和慢性期表达则持续在更高水平；③急性期表达上调并在慢性期持续高表达；④在感染后3周表达下调后持续低表达。3.通过吡喹酮杀虫治疗对日本血吸虫感染小鼠HSCs基因表达谱影响的研究,筛选出1075个差异基囚,它们主要参与调节14个生物学过程(p<0.05)。其中基因参与数目最多的是免疫和防御(132个基因)。因此,血吸虫感染引起HSCs的基因表达谱显著变化,而吡喹酮治疗可逆转其中部分基因的变化趋势,这些基因参与调节的主要生物学过程与HSCs活化、迁移、细胞形态改变和凋亡等密切相关。其中VEGF和IL-6在基因间的调控网络中处于中心地位,它们在血吸虫病肝纤维化发生和转归中可能起到关键作用。4.血吸虫感染组小鼠肝脏VEGF阳性细胞数量较正常组明显增多,而吡喹酮治疗组小鼠肝脏VEGF阳性细胞数量则显著低于感染组,提示吡喹酮治疗抑制血吸虫感染小鼠慢性期肝脏VEGF的表达。我们还发现,a-SMA和VEGF双阳性细胞数量在感染组显著高于正常组,而吡喹酮治疗组则显著低于感染组,提示吡喹酮治疗不仅抑制了肝脏整体的VEGF水平,而且也抑制了HSCs表达VEGF水平。5.虫源性抗原SWAP和SEA在体外抑制HSCs的活化水平及其产生胶原的能力,但在感染小鼠中HSCs活化水平升高、产生胶原增多,且SWAP和SEA刺激LX-2表达VEGF水平上升的变化强度也不及感染小鼠体内HSCs,这提示,虫源性抗原在体内可能并不是直接活化HSCs,并使其产生胶原和VEGF表达增加。6. SWAP浓度达到20μg/mL时可显著增加HUVEC培养上清中VEGF水平(P<0.001),且呈剂量依赖关系。SEA则在浓度为10μg/mL时就可显著刺激HUVEC培养上清中VEGF水平的增加(P<0.001),且呈剂量依赖关系。在相同抗原浓度时,SEA刺激HUVEC培养上清中VEGF增加的作用更强。SWAP和SEA对HUVEC表达VEGF转录水平的影响与蛋白水平上的基本一致7. VEGF刺激LX-2后,其a-SMA和Col1a1的mRNA转录水平均显著增高,提示VEGF可刺激HSCs活化并使其产生I型胶原水平增加；10ng/mL VEGF也可显著刺激LX-2增殖。