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研究背景和目的:肝细胞癌是一种发病率高危害性大的原发性肝脏肿瘤,是癌症相关死亡的第二大原因,并且肝细胞癌的发病率在全球范围内依旧是呈上升趋势。在我国,大多数肝癌患者被发现时往往已经失去了根治性手术切除的机会,这是由于肝癌本身的发生发展机制决定的。尽管近几十年来人们在肝癌的研究方面取得了巨大的进展,但是肝癌的发生发展尤为复杂,其具体的机制仍有待探究。通过探究肝癌发生发展的机制,可以为肝癌的诊断以及肝癌的治疗提供新的思路,这将有助于肝细胞癌患者的治疗和预后。HSPA4作为一种热休克蛋白在细胞内蛋白质稳态的维持方面发挥着重要作用。此外,近几年的研究表明HSPA4与肿瘤的发生发展也息息相关。我们实验团队前期的研究也发现HSPA4与肝细胞癌的增殖有关。然而,HSPA4在肝细胞癌中具体是如何发挥作用的目前仍不清楚。为了进一步研究HSPA4在肝细胞癌中的作用机制,我们通过RNA-seq测序分析了干扰HSPA4以后肝癌细胞内基因和生物学过程的变化情况,结果发现干扰HSPA4以后NDRG1的表达水平明显下降,并且HIF1信号通路受到了抑制。此外,有研究表明HIF1-α可以结合NDRG1的启动子,促进NDRG1的表达。HIF1是HIF1信号通路中的关键效应蛋白,具有广泛的靶基因谱,而HIF1-α是HIF1的活性亚基,在该信号通路中发挥着重要作用。据此,我们推测HSPA4可能通过HIF1信号通路调控NDRG1进而影响肝癌细胞的增殖。为了验证我们的假设,我们进行了以下实验:方法:1.通过HCCLM3细胞系建立稳定干扰HSPA4的细胞系,通过对构建成功的sh HSPA4-HCCLM3细胞和NC-HCCLM3细胞进行RNA-seq测序,然后使用生物信息学对测序的差异基因进行分析,探索干扰HSPA4以后,肝癌细胞中与HSPA4有关的生物学过程以及分子功能的改变。2.通过TCGA数据库和GEPIA数据库分析肝癌患者的HSPA4、NDRG1的表达水平和二者表达的相关性并探索它们与临床指标的相关性。3.探索各种肝癌细胞系中HSPA4和NDRG1的表达情况,进一步通过干扰和过表达HSPA4,检测HSPA4和NDRG1的表达变化情况,通过CCK8、平板克隆和EDU实验来检测肝癌细胞的增殖能力。然后,进行体内实验。使用慢病毒构建稳定干扰HSPA4的稳转细胞系,通过构建裸鼠皮下成瘤模型探索HSPA4对肿瘤增殖能力的影响。4.通过回复实验探索HSPA4和NDRG1的上下游关系,在肝癌细胞中干扰HSPA4的表达同时增加NDRG1的表达,观察HSPA4和NDRG1的表达情况,同时,通过EDU实验检测肝癌细胞的增殖情况;过表达HSPA4的同时干扰NDRG1的表达,观察HSPA4和NDRG1的表达情况,同时,通过EDU实验检测肝癌细胞的增殖情况。5.通过Western blot、蛋白免疫共沉淀以及激光共聚焦等方法探索HSPA4通过HIF1-α调控NDRG1的分子机制。结果:1.我们对构建成功的sh HSPA4-HCCLM3细胞和NC-HCCLM3细胞进行RNA-seq测序后的结果进行分析发现,干扰HSPA4以后623个基因表达显著上调,583个基因表达显著下降。然后我们使用Metascape分析发现HIF1信号通路和类固醇的代谢等生物学过程和分子功能受到显著影响。并且HIF1-α的下游蛋白NDRG1的表达水平在干扰HSPA4以后也明显下降。2.我们通过对TCGA数据库中肝癌患者的转录组学数据进行分析发现HSPA4和NDRG1在肝癌组织中表达量均显著高于癌旁组织,并且二者的表达呈正相关（r=0.314,P＜0.001）通过GEPIA数据库分析发现二者的高表达均和患者的预后呈显著负相关,进一步,通过单因素和多因素分析发现,HSPA4和NDRG1均与HCC的预后有很强的相关性（P＜0.05）。3.我们发现HSPA4和NDRG1在肝癌细胞中的表达高于正常肝细胞,同时,干扰HSPA4以后,NDRG1的表达下降,并且平板克隆、CCK8和EDU实验均发现肝癌细胞的增殖能力受到了抑制;过表达HSPA4以后,NDRG1的表达升高,并且平板克隆、CCK8和EDU实验均发现肝癌细胞的增殖能力受到了促进。裸鼠的皮下成瘤实验也发现,LV-sh HSPA4组老鼠的肿瘤体积、质量、荧光强度均小于LV-Control组（P＜0.01）4.我们通过回复实验发现干扰HSPA4的同时过表达NDRG1,可以回复干扰HSPA4造成的肝癌增殖能力的下降;过表达HSPA4的同时干扰NDRG1,可以降低过表达HSPA4造成的肝癌增殖能力的增强。5.我们进一步分析了HSPA4、HIF1-α和NDRG1之间的关系发现,HSPA4可以通过抑制HIF1-α的泛素化降解进而使HIF1-α高表达来促进NDRG1的表达,从而促进肝癌细胞的增殖。结论:通过实验发现HSPA4对HIF1信号通路有着重要影响,HSPA4可以抑制HIF1-α的泛素化降解使其高表达,进而促进NDRG1的高表达,从而促进肝癌细胞增殖,这一发现初步揭示了HSPA4影响肝癌增殖的机制,对肝细胞癌的治疗有着重要的意义。