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第一部分：壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架局部持续释放神经生长因子用于慢性神经卡压损伤的治疗
目的：
探索搭载神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架在慢性神经卡压损伤治疗中的应用。
方法：
首先采用溴化锂提取法从丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧(140 Nd-s)中提取了丝胶蛋白。将壳聚糖(chitosan，CS)与丝胶蛋白(sericin，SS)按照设置好的体积比共混(CS100/SS0，CS80/SS20，CS50/SS50，CS20/SS80，CS0/SS100)，利用京尼平进行交联，制备了壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架。分别采用吸水膨胀测试、乙醇替代法、扫描电子显微镜检查以及压缩测试对复合生物支架的吸水膨胀率、孔隙率、微观结构以及机械性能等物理特征进行了描述。然后，将大鼠雪旺细胞RSC96细胞接种于复合生物支架表面，检测材料的生物相容性。接着，制备复合生物支架的降解产物，分别检测降解产物对(1)RSC96细胞表达神经再生相关因子的影响；(2)小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞表达炎症因子的影响；(3)未分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞生长分化的影响。最后，建立大鼠坐骨神经慢性卡压损伤模型，采用组织工程治疗策略即CS50/SS50复合生物支架搭载NGF(NGF/scaffold)对大鼠坐骨神经慢性卡压损伤进行治疗，通过足底热刺激伤害感受阈测试、足底机械刺激伤害感受阈测试、神经传导速度检测以及腓肠肌分析评价神经功能学的恢复情况，通过髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、β-3微管蛋白(β-3tubulin)的免疫荧光染色以及透射电子显微镜检查评价神经组织结构的修复情况。
结果：
(1)复合生物支架具备高孔隙率(大于80%)与适宜的孔径大小(130-146μm)，机械性能与吸水膨胀性能可根据壳聚糖与丝胶蛋白不同的体积配比进行调节；(2)复合生物支架拥有良好的生物相容性，可以支持RSC96细胞的长时程(9天)存活与增殖；(3)随着复合生物支架中丝胶蛋白比例的增加，支架降解产物可以显著上调RSC96细胞中促神经再生相关因子的mRNA水平，包括胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)(CS0/SS100组为CS100/SS0组的5.24倍)、早期生长反应蛋白2(early growth response protein 2 ， EGR2 )(CS0/SS100组为CS100/SS0组的6.01倍)、神经细胞粘附分子(NCAM，neural cell adhesion molecule)((CS0/SS100组为CS100/SS0组的2.31倍)；同时可以显著下调RAW264.7细胞中炎症因子的mRNA水平，包括肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)((CS0/SS100组为CS100/SS0组的0.74倍)和白细胞介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)(CS0/SS100组为CS100/SS0组的0.34倍)；(4)壳聚糖与丝胶蛋白体积比为1：1(CS50/SS50)时，复合生物支架表现出最好的神经细胞亲和力；(5)在治疗后第4周，组织工程治疗策略显著缓解了大鼠的神经痛症状，提高了坐骨神经的神经传导速度(空白对照组为46.3m/s，而NGF/scaffold组为63.4m/s)，促进了神经微观结构的修复(空白对照组髓鞘厚度为0.77μm，而NGF/scaffold组为1.44μm)，改善了腓肠肌的萎缩(空白对照组腓肠肌相对湿重为84.39%，而NGF/scaffold组为93.76%)。
结论：
壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架局部持续释放NGF可以有效促进慢性神经卡压损伤的修复，为将来丝胶蛋白、壳聚糖的临床转化以及慢性神经卡压损伤的临床治疗提供了新思路。
第二部分：丝胶蛋白神经导管搭载氯倍他索促进长距离神经缺损功能和结构的修复
目的：
探索搭载氯倍他索的丝胶蛋白神经导管在长距离神经缺损治疗中的应用。
方法：
首先采用溴化锂提取法从丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧(140 Nd-s)中提取了丝胶蛋白。以丝胶蛋白为原材料，戊二醛为交联剂，制备了丝胶蛋白神经导管(glutaraldehyde cross-linked sericin conduit，GSC)与丝胶蛋白生物膜(glutaraldehyde cross-linked sericin film，GSF)。分别采用吸水膨胀测试、乙醇替代法、扫描电子显微镜检查以及压缩测试对GSC的吸水膨胀率、孔隙率、微观结构以及机械性能等物理特征进行了描述。然后，检测了GSF对大鼠雪旺细胞RSC96细胞生长、增殖以及表达神经营养因子的影响。接着，检测了氯倍他索对RSC96细胞生长、增殖以及表达促髓鞘再生相关因子的影响。最后，将搭载氯倍他索的丝胶蛋白神经导管(Clobetasol/GSC)用于桥接大鼠坐骨神经10mm缺损，通过静态坐骨神经指数计算、足底热刺激伤害感受阈测试、神经传导速度检测以及腓肠肌分析评价神经功能学的恢复情况，通过S100、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、β-3微管蛋白(β-3tubulin)、CD34的免疫荧光染色以及卢克索固蓝(LFB)髓鞘染色评价神经组织结构的修复情况。
结果：
(1)GSC具备高孔隙率(82.56%)与适宜的孔径大小(36.73μm)；(2)GSF拥有良好的生物相容性，可以选择性地促进RSC96细胞分泌神经营养因子神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)(在培养第7天实验组的蛋白水平为对照组的3.48倍)和神经营养素-4(neurotrophin-4，NT-4)(在培养第7天实验组的蛋白水平为对照组的3.75倍)；(3)氯倍他索可以促进RSC96细胞的增殖以及RSC96细胞中促髓鞘再生相关因子NRG1与EGR2的转录(实验组NRG1的mRNA水平为对照组的2.84倍，实验组EGR2的mRNA水平为对照组的15.83倍)和翻译；(4)Clobetasol/GSC移植治疗成功地引导10mm离断神经的再生，在神经功能学与组织学上的修复效率均显著高于GSC移植治疗；(5)在治疗后第12周，根据静态坐骨神经指数、相对反应时间、神经传导速度三个指标的对比分析，Clobetasol/GSC组分别为-74.55、1.30及46.4m/s，自体神经移植组分别为-64.53、1.23及49.8m/s，两组在神经功能学上的修复效率相匹配。
结论：
氯倍他索可以促进RSC96细胞的增殖以及其表达促髓鞘再生相关因子，有望成为用于外周神经缺损治疗的药物。氯倍他索的掺入显著提高了丝胶蛋白神经导管的功效，有效促进了外周神经组织结构和功能的再生，具备良好的临床转化前景。
目的：
探索搭载神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架在慢性神经卡压损伤治疗中的应用。
方法：
首先采用溴化锂提取法从丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧(140 Nd-s)中提取了丝胶蛋白。将壳聚糖(chitosan，CS)与丝胶蛋白(sericin，SS)按照设置好的体积比共混(CS100/SS0，CS80/SS20，CS50/SS50，CS20/SS80，CS0/SS100)，利用京尼平进行交联，制备了壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架。分别采用吸水膨胀测试、乙醇替代法、扫描电子显微镜检查以及压缩测试对复合生物支架的吸水膨胀率、孔隙率、微观结构以及机械性能等物理特征进行了描述。然后，将大鼠雪旺细胞RSC96细胞接种于复合生物支架表面，检测材料的生物相容性。接着，制备复合生物支架的降解产物，分别检测降解产物对(1)RSC96细胞表达神经再生相关因子的影响；(2)小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞表达炎症因子的影响；(3)未分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞生长分化的影响。最后，建立大鼠坐骨神经慢性卡压损伤模型，采用组织工程治疗策略即CS50/SS50复合生物支架搭载NGF(NGF/scaffold)对大鼠坐骨神经慢性卡压损伤进行治疗，通过足底热刺激伤害感受阈测试、足底机械刺激伤害感受阈测试、神经传导速度检测以及腓肠肌分析评价神经功能学的恢复情况，通过髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、β-3微管蛋白(β-3tubulin)的免疫荧光染色以及透射电子显微镜检查评价神经组织结构的修复情况。
结果：
(1)复合生物支架具备高孔隙率(大于80%)与适宜的孔径大小(130-146μm)，机械性能与吸水膨胀性能可根据壳聚糖与丝胶蛋白不同的体积配比进行调节；(2)复合生物支架拥有良好的生物相容性，可以支持RSC96细胞的长时程(9天)存活与增殖；(3)随着复合生物支架中丝胶蛋白比例的增加，支架降解产物可以显著上调RSC96细胞中促神经再生相关因子的mRNA水平，包括胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)(CS0/SS100组为CS100/SS0组的5.24倍)、早期生长反应蛋白2(early growth response protein 2 ， EGR2 )(CS0/SS100组为CS100/SS0组的6.01倍)、神经细胞粘附分子(NCAM，neural cell adhesion molecule)((CS0/SS100组为CS100/SS0组的2.31倍)；同时可以显著下调RAW264.7细胞中炎症因子的mRNA水平，包括肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)((CS0/SS100组为CS100/SS0组的0.74倍)和白细胞介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)(CS0/SS100组为CS100/SS0组的0.34倍)；(4)壳聚糖与丝胶蛋白体积比为1：1(CS50/SS50)时，复合生物支架表现出最好的神经细胞亲和力；(5)在治疗后第4周，组织工程治疗策略显著缓解了大鼠的神经痛症状，提高了坐骨神经的神经传导速度(空白对照组为46.3m/s，而NGF/scaffold组为63.4m/s)，促进了神经微观结构的修复(空白对照组髓鞘厚度为0.77μm，而NGF/scaffold组为1.44μm)，改善了腓肠肌的萎缩(空白对照组腓肠肌相对湿重为84.39%，而NGF/scaffold组为93.76%)。
结论：
壳聚糖/丝胶蛋白复合生物支架局部持续释放NGF可以有效促进慢性神经卡压损伤的修复，为将来丝胶蛋白、壳聚糖的临床转化以及慢性神经卡压损伤的临床治疗提供了新思路。
第二部分：丝胶蛋白神经导管搭载氯倍他索促进长距离神经缺损功能和结构的修复
目的：
探索搭载氯倍他索的丝胶蛋白神经导管在长距离神经缺损治疗中的应用。
方法：
首先采用溴化锂提取法从丝素缺失型突变品种的家蚕蚕茧(140 Nd-s)中提取了丝胶蛋白。以丝胶蛋白为原材料，戊二醛为交联剂，制备了丝胶蛋白神经导管(glutaraldehyde cross-linked sericin conduit，GSC)与丝胶蛋白生物膜(glutaraldehyde cross-linked sericin film，GSF)。分别采用吸水膨胀测试、乙醇替代法、扫描电子显微镜检查以及压缩测试对GSC的吸水膨胀率、孔隙率、微观结构以及机械性能等物理特征进行了描述。然后，检测了GSF对大鼠雪旺细胞RSC96细胞生长、增殖以及表达神经营养因子的影响。接着，检测了氯倍他索对RSC96细胞生长、增殖以及表达促髓鞘再生相关因子的影响。最后，将搭载氯倍他索的丝胶蛋白神经导管(Clobetasol/GSC)用于桥接大鼠坐骨神经10mm缺损，通过静态坐骨神经指数计算、足底热刺激伤害感受阈测试、神经传导速度检测以及腓肠肌分析评价神经功能学的恢复情况，通过S100、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、β-3微管蛋白(β-3tubulin)、CD34的免疫荧光染色以及卢克索固蓝(LFB)髓鞘染色评价神经组织结构的修复情况。
结果：
(1)GSC具备高孔隙率(82.56%)与适宜的孔径大小(36.73μm)；(2)GSF拥有良好的生物相容性，可以选择性地促进RSC96细胞分泌神经营养因子神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)(在培养第7天实验组的蛋白水平为对照组的3.48倍)和神经营养素-4(neurotrophin-4，NT-4)(在培养第7天实验组的蛋白水平为对照组的3.75倍)；(3)氯倍他索可以促进RSC96细胞的增殖以及RSC96细胞中促髓鞘再生相关因子NRG1与EGR2的转录(实验组NRG1的mRNA水平为对照组的2.84倍，实验组EGR2的mRNA水平为对照组的15.83倍)和翻译；(4)Clobetasol/GSC移植治疗成功地引导10mm离断神经的再生，在神经功能学与组织学上的修复效率均显著高于GSC移植治疗；(5)在治疗后第12周，根据静态坐骨神经指数、相对反应时间、神经传导速度三个指标的对比分析，Clobetasol/GSC组分别为-74.55、1.30及46.4m/s，自体神经移植组分别为-64.53、1.23及49.8m/s，两组在神经功能学上的修复效率相匹配。
结论：
氯倍他索可以促进RSC96细胞的增殖以及其表达促髓鞘再生相关因子，有望成为用于外周神经缺损治疗的药物。氯倍他索的掺入显著提高了丝胶蛋白神经导管的功效，有效促进了外周神经组织结构和功能的再生，具备良好的临床转化前景。