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采用紫外分光光度法结合气相色谱法对分离自四川酸泡菜、婴儿粪便和发酵玉米秸秆的菌株进行了产CLA的筛选,以期获得具有转化LA生成cis9,trans11CLA和trans10,cis12CLA两种有生理活性异构体的高产菌株。并运用形态学特征、生理生化特征分析等细菌学鉴定的经典方法以及16SrDNA序列分析,对所筛选出CLA产量较高,而且来源不同的菌株进行了鉴定,确定了菌株的分类地位。进一步确定了菌株的最优发酵底物,优化了菌株的生长条件和发酵工艺参数。得到以下结果:
(1)用紫外分光光度法,从来自四川酸泡菜、婴儿粪便和发酵玉米秸秆的已经纯化的150株菌中,筛选到具有发酵转化LA为CLA的菌株37株。其中,25株菌在233nm处有特征吸收峰,3株菌在232nm处有特征吸收峰,9株菌在234nm处有特征吸收峰。
(2)运用气相色谱法对筛选到的37株菌产的CLA是否为具有生理活性的c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA进行确定。结果显示:37株菌均具有产c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA的能力,且产c-9,t-11CLA的能力高于产t-10,c-12CLA的能力。37株菌中产量最高的是菌株PC-21,c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA产量分别为317.219μg/L和250.734μg/L,CLA总产量为567.952μg/L。
(3)挑选5株产c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA能力较高的菌株(YE1、YE6、PC-21、PC-24和LA62)进行鉴定,发现5株菌在MRS培养基上的菌落较小,菌落直径为1~3mm,颜色为白色,边缘整齐光滑。对5株菌进行革兰氏染色,均为紫色G+,YE1和YE6为圆形,PC-21、PC-24和LA62为短杆状。依据16SrDNA全序列分析和生理生化鉴定确定菌株YE1和YE6的分类地位属于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis),菌株PC-21、PC-24和LA62的分类地位属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
(4)通过pH值、装液量、接种量和培养基组份对菌株PC-21生长影响的研究表明:菌株PC-21生长的最佳pH值为6.8,最佳接种量为3%,装液量对菌株生长的影响不大;培养基碳源、氮源、pH值对菌株生长的影响从大到小依次为:氮源>碳源>pH值,最佳培养基组份为蔗糖、蛋白胨、pH8。
(5)对菌株PC-21转化LA为CLA的发酵条件研究发现:PC-21的最佳发酵底物为芝麻油;PC-21发酵生成CLA的最佳pH值为6.8,最佳发酵温度为37C,底物中LA的最适浓度为3mg/mL,发酵36h时,检测发酵液中的CLA值最大,为29.21μg/mL。