论文部分内容阅读
黄酮类化合物如芦丁、橙皮苷、柚皮苷是一类在植物中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物,由苷元和二糖通过糖苷键相连。化学法或生物酶法水解糖苷得到具有生物活性的苷元或黄酮单糖苷。化学法水解黄酮苷需要强酸,并且不能选择性水解糖苷键。与化学法相比,生物酶法水解黄酮苷具有条件温和、专一水解特定的糖苷键等优点。本文以源自黑曲霉WZ001(Aspergillus niger WZ001)的胞外α-L-1,2-鼠李糖苷酶和α-L-1,6-鼠李糖苷酶为生物催化剂,催化芦丁、柚皮苷、橙皮苷等的水解得到对应的苷元槲皮素、柚皮素、橙皮素。从植物乳酸杆菌WZ011基因组DNA中克隆、表达了一个α-L-1,6-鼠李糖苷酶,并应用于水解橙皮苷得到橙皮素单糖苷。此外,对源自植物乳酸杆菌WZ011的α-L-1,6-鼠李糖苷酶在毕赤酵母酵母中的重组表达进行了探索论文的主要研究结果如下:1.以黑曲霉WZ001(Aspergillus niger WZ001)为出发菌株进行液体深层培养产鼠李糖苷酶,并对其产酶条件进行了优化。结果表明,当以0.1%(w/v)芦丁和0.1%(w/v)柚皮苷的混合物为诱导物时,α-L-1,6-鼠李糖苷酶在发酵60 h达到最大酶活1260 U/ml,α-L-1,2-鼠李糖苷酶在发酵84 h达到最大酶活1489 U/ml。以25%(v/v)DMSO为助溶剂,酶解最适温度50℃,最适pH为5,2%海藻酸钠固定化酶对10%的底物进行酶解,芦丁10 h水解完全,柚皮苷6 h水解完全,橙皮苷反应14 h水解约60%左右。固定化酶反应7次后酶活保持在60%左右。D4020树脂对水解得到的苷元进行吸附回收1次,回收率在94%左右。产物经硅胶薄层层析分离纯化后三种产物槲皮素、橙皮素、柚皮素的纯度均在99%以上。2.从植物乳酸杆菌基因组DNA中克隆了α-L-1,6-鼠李糖苷酶基因并在大肠杆菌中实现了过量表达,其酶活高达127 U/mg。重组的α-L-1,6-鼠李糖苷酶为双功能酶,兼有β-D-葡萄糖苷酶的活力,可水解橙皮苷得到橙皮素。30%(v/v)DMSO作为助溶剂时,β-D-葡萄糖苷酶活力被抑制,从而获得单一产物橙皮素单糖苷。在最适pH 5、最适温度55℃以及最适底物浓度3%下水解反应10 h,水解产物通过D4020树脂进行吸附回收3次,回收率可达91%回收的产物经硅胶薄层层析分离纯化,其纯度可达99%。3.为了构建表达α-L-1,6-鼠李糖苷酶的酵母基因工程菌,将源自植物乳酸杆菌的α-L-1,6-鼠李糖苷酶编码基因克隆,并连接于质粒pPICZαA,将所获得的重组质粒转入毕赤酵母GS115。酵母基因工程菌经甲醇诱导表达,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,然而对不同底物进行水解均未检测到酶活。