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皮肤中黑色素的种类、数量决定了动物的肤色和毛色,黑色素的生成极其复杂,涉及毛色形成的调控基因有很多,如TYR、TYRP1、TYRP2/DCT、MITF、α-MSH、MC1R、KIT、ASIP基因等,其中TYR、TYRP1、TYRP2/DCT是黑色素生物合成的关键酶,α-MSH/MC1R是黑色素合成的关键信号通路,MITF是调控黑色素形成关键酶的重要转录因子。MicroRNAs(miRNA,miR)是一类由约20个核苷酸组成的非编码单链小RNA,通过与靶mRNAs3’-UTR退火结合对靶基因进行转录后调控,参与细胞的发生、增殖、分化和凋亡等多个生物学过程。近年来发现microRNAs对黑色素的生成也有重要的调控作用。本研究通过对黑色素生成通路分析,生物信息学软件预测,筛选目标基因与miRNA;构建真核表达载体;进行黑色素细胞转染和添加;通过各种生物学检测手段揭示miRNA对毛色形成机制的调控作用。试验内容如下:1.通过对调控色素形成通路的分析,选择在黑色素形成中发挥重要调控作用的MITF基因;运用miRbase和TargetScan数据库预测、筛选与目标基因MITF相结合的miR-186-5p;利用荧光定量PCR检测绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和MITF的表达差异;构建靶基因MITF的3’UTR双荧光报告载体和miR-186-5p过表达载体;运用双荧光报告验证miR-186和MITF的靶向关系。2.利用细胞转染技术在绵羊黑色素细胞中转染miR-186-5p、inhibitor和相应的NC表达载体,通过分光光度法检测转染细胞中黑色素含量;通过荧光定量PCR检测转染细胞中miR-186-5p、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2mRNA的表达;通过免疫印迹检测MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的蛋白表达;通过免疫组化检测转染后细胞中MITF的原位表达;通过细胞划痕实验检测转染细胞的迁移和增值。3.通过细胞培养和原位杂交技术检测miR-186-5p在绵羊黑色素细胞中的定位和分布。4.miR-186-5p和α-MSH对黑色素的合成都具有调控功能,在绵羊黑色素细胞中转染miR-186-5p表达质粒的同时添加一定浓度的α-MSH,然后检测miR-186-5p和α-MSH协同作用对绵羊黑色素细胞色素生成的影响,通过分光光度法检测细胞中的黑色素含量;通过荧光定量PCR检测细胞中MITF、TYR、TYRP1、TYRP2 mRNA的表达;通过免疫印迹检测MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的蛋白表达;通过细胞免疫组化检测细胞中MITF的原位表达;通过细胞划痕实验检测细胞的迁移和增值。结果如下:1.miRNAs数据库预测MITF是miR-186-5p的靶基因;荧光定量PCR检测结果显示miR-186-5p在绵羊黑色皮肤中表达量显著低于白色皮肤,而MITF则在绵羊黑色皮肤中显著高表达;MITF 3’ UTR双荧光报告载体和miR-186-5p真核表达载体共转染HEK293 T细胞后荧光活性降低了 40%。2.绵羊黑色素细胞中转染miR-186-5p、inhibitor和相应的NC表达载体后,焚光定量PCR、免疫印迹、免疫组化试验结果显示miR-186-5p过表达在mRNA水平、蛋白水平以及在细胞内都抑制靶基因MITF的表达;荧光定量PCR、免疫印迹结果显示miR-186-5p过表达也抑制了 TYR、TYRP1和TYRP2的表达;分光光度检测结果显示miR-186-5p过表达使黑色素细胞中黑色素含量减少;划痕试验验结果显示miR-186-5p过表达抑制了黑色素细胞的增殖和迁移3.原位杂交结果显示miR-186-5p在黑色素细胞核和细胞质都有分布。4.荧光定量PCR、免疫印迹、免疫组化试验结果显示miR-186-5p与α-MSH协同作用绵羊黑色素细胞后,在mRNA水平、蛋白水平以及在细胞内都能缓解miR-186-5p对靶基因MITF的抑制作用;荧光定量PCR、免疫印迹结果显示miR-186-5p与α-MSH协同作用也缓解了 miR-186-5p对TYR、TYRP1和TYRP2的抑制作用;分光光度检测结果显示miR-186-5p与α-MSH协同作用缓解了 miR-186-5p使黑色素含量减少的程度;划痕实验结果显示miR-186-5p与α-MSH协同作用不影响miR-186-5p对黑色素细胞增殖和迁移的抑制作用。