目的：原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)是发生于肝实质细胞或肝内胆管上皮细胞的癌。是我国主要的恶性肿瘤之一,年发病率为10～150/10万人,仅次于肺癌和胃癌,是我国第三位的恶性肿瘤,其年死亡率约34.6/10万人,仅次于肺癌,居第二位。原发性肝癌也是肝硬化患者的主要死亡原因。其在全世界也属于常见病,原发性肝癌在恶性肿瘤发病率中居世界第5位,死亡率居第3位。目前,我国每年新发原发性肝癌约35万例,占全世界新发病例的55%。每年死于原发性肝癌的人数约32万人,占全世界原发性肝癌总死亡人数的45%。大多数原发性肝癌患者在就诊时已是中晚期,手术率仅有5%-10%左右,5年生存率约为3%～5%。目前,原发性肝癌的高发病率,高病死率及其逐年增高的趋势,已成为一个非常严重的国际卫生问题,严重危害了人类的健康。早期诊断和早期治疗是提高患者生存率的关键。但目前的诊断方法在敏感度和特异性上均较低,已成为原发性肝癌诊断和治疗的一个瓶颈。目前临床上仅以AFP一种蛋白作为血清学诊断指标,在敏感性和特异性上是远远不够的。目前,原发性肝癌的病因和发病机制还没有完全阐明。原发性肝癌作为一种高病死率的恶性肿瘤疾病,现有的化疗和放疗已经远远不能满足治疗的需要,而原发性肝癌的基因诊断和治疗具有广阔的应用前景。目前认为人类肿瘤的发生、发展是控制正常细胞增殖、分化和凋亡的多个基因突变的结果,基因的突变包括致癌基因的活化和抑癌基因的失活。ras基因是人类肿瘤基因中最容易突变的基因之一,ras基因突变在人类的各种肿瘤细胞中广泛存在,并在肿瘤进一步发展的过程中起到重要的作用,突变的ras基因可刺激细胞增殖并抑制细胞凋亡从而促使肿瘤的发生、发展。在所有的人类肿瘤细胞中,ras基因的突变占20%-30%,并且其突变与肿瘤的分期和浸润转移存在一定的相关性。ras基因突变发生率最高的是胰腺癌(90%),其次为结肠癌(50%)和肺癌(30%),胃癌较低,在10%以下。ras基因突变最常见的位点是12、13、61密码子。ras基因单点突变足以引发细胞恶性转化。在肿瘤克隆的形成过程中,由于基因的变化早于形态的变化,对癌变基因及其产物的检测必然有助于癌变的早期检出。法呢基转移酶(famesytransferase, FTase)己分别从牛、大鼠、猪等哺乳动物中被分离纯化提出,是一种位于细胞质的异型二聚体酶,由α和β二个亚基组成,分子量分别在48,46kD附近。FTase也是一种金属酶,能催化部分细胞多肽翻译后修饰的第一步骤(法呢基化),其底物包括：ras蛋白,核纤层蛋白A,B,磷酰化酶激酶,cGMP磷酸二酯酶的α亚单位和转导素的γ亚单位等。FTase催化ras蛋白脂类修饰的第一步反应,即首先识别ras蛋白C木端的CAAX四肽(C为半胱氨酸,A为脂肪族氨基酸,X为蛋氨酸或色氨酸),然后把焦磷酸法呢基酯(FPP)的法呢基转到CA1A2X的半胱氨酸巯基上,这一步对ras蛋白的细胞膜定位和生物活性是必不可少的。ras基因的法呢基化极大提高了其激活下游信号转导酶的能力,包括哺乳动物细胞中具有有丝分裂活性的蛋白激酶。未经法呢基化的ras蛋白不能与细胞胞膜结合,同时也不能使细胞发生恶性转化。所以,法呢基蛋白转移酶的活性高低、是否被抑制对细胞的恶性转化非常重要。研究发现,将法呢基转移酶过度表达的细胞接种裸鼠可导致肿瘤发生,但其与ras基因过度表达的细胞注入裸鼠形成的肿瘤表型有明显不同,提示法呢基转移酶可能直接参与细胞生长转化以及恶性肿瘤的形成机制。最近十年,法呢基转移酶已经成为肿瘤治疗的重要靶标,并且成为抗肿瘤研究的热点,虽然法呢基转移酶抑制剂已经用于肿瘤的治疗,但其确切的机制尚未阐明。本课题属于临床基础研究,主要目的是研究原发性肝癌中H-ras、N-ras、K-ras基因的表达和突变情况,并研究ras基因的过度表达和突变与原发性肝癌临床病理特征以及肿瘤转移的关系,以探讨ras基因在原发性肝癌发生、发展以及转移过程中的作用。并研究法呢基转移酶(FTase)在原发性肝癌组织中的表达及其过度表达与原发性肝癌临床病理特征以及肿瘤转移复发的关系,以探讨法呢基转移酶在原发性肝癌发生、发展以及转移复发过程中的作用。为原发性肝癌的诊断与治疗提供一种新的方法。通过一系列的研究,建立和完善原发性肝癌的早期筛查手段,为原发性肝癌的诊断寻找一种更为敏感、简便、易行的肿瘤标志物,同时为寻找一种针对法呢基转移酶的药物用于原发性肝癌的临床治疗提供理论指导。方法：32例原发性肝癌组织标本,分别取癌瘤的中央部位及其远端正常组织,标本离体后立即无菌状态下切取,迅速置入液氮中速冻,-80℃保存。标本均经病理检查证实诊断。32例标本中,肿瘤直径大于5cm的24例,小于5cm的8例,肿瘤包膜完整的16例,包膜不完整的16例,32例标本中Edmondson分级Ⅰ级或Ⅱ级的12例,Ⅲ级或Ⅳ级的20例。患者平均年龄57.9±13.4(22-73)岁,男23例,女9例,其中27例有乙肝病史,有肝硬化病史17例,血清AFP阳性的20例,阴性的12例。32例病人中14例TNM分期为Ⅰ期或Ⅱ期,18例TNM分期为Ⅲ期或Ⅳ期。根据手术记录和术后病理资料,肝内有癌栓、转移结节以及有淋巴结转移的病人划分为高转移复发潜能组,有18例,14例肝内没有癌栓、转移结节及淋巴结转移的划分为低转移复发潜能组。共有28例病人随访16-30个月,有肿瘤复发和转移的19例。采用HotStarTaq PCR检测32例原发性肝癌和癌旁正常组织中H-ras、N-ras、 K-ras基因的表达并采用PCR直接测序法分析H-ras、N-ras、K-ras基因的突变情况,并统计分析ras基因突变与原发性肝癌临床病理特征以及肿瘤转移的关系。采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法测定32例原发性肝癌组织及癌旁正常肝组织中法呢基转移酶的表达,并统计分析其高表达与原发性肝癌临床病理特征以及肿瘤转移复发的关系。结果：在32例原发性肝癌组织及癌旁正常组织中均可检测到H-ras、N-ras、K-ras基因的表达,肝癌组织中ras基因表达率高于正常组,但二者差异不显著(P>0.05)。32例原发性肝癌标本PCR结果经测序后,17例标本发现H-ras基因发生突变(17/32,53.1%),14例40密码子中A突变成G,3例62密码子中G突变成A,K-ras、N-ras基因未发生突变,癌旁正常组织未发现ras基因突变。ras基因过度表达与原发性肝癌的发生、发展有关,H-ras基因突变与原发性肝癌的发生、发展及转移有关。在32例原发性肝癌组织中均可检测到法呢基转移酶的表达,原发性肝癌组织中FTase mRNA较正常肝组织中FTase mRNA有显著性的增加(P<0.001),其中FTase基因高表达28例(87.5%)。高转移复发潜能组患者的FTase mRNA表达明显高于低转移复发潜能组(P=0.02)。复发组患者的FTase mRNA表达明显高于非复发组患者(P=0.01)。结论：三种ras基因异常表达是原发性肝癌发生的早期分子改变,可能ras基因激活导致了原发性肝癌的发生与发展。H-ras基因点突变导致基因激活,从而导致了原发性肝癌的发生、发展与转移。K-ras、N-ras基因没有突变,提示其激活机制及致癌与突变无关,可能与其过度表达有关。对ras基因及其产物P21蛋白的更深入的研究将为原发性肝癌的预防、诊断及治疗提供更新更好的方法。因此,检测ras基因的异常表达及突变对了解原发性肝癌的发生、发展及转移,以及监测原发性肝癌的治疗效果具有重大意义,对临床工作具有重要指导意义。原发性肝癌组织中FTase mRNA明显高于癌旁组织,提示FTase在原发性肝癌形成过程中起了重要的作用,FTase不是通过活化ras基因发挥其致瘤作用,可能FTase直接参与了细胞的癌变过程,FTase活性可能是原发性肝癌发生的标志物。FTase有望成为原发性肝癌诊断的一项指标。FTase可能是肿瘤转移研究中稳定表达的生物学标记物,可用于预测原发性肝癌的临床转移。同时,FTase也可能用于预测原发性肝癌患者的术后复发。进一步研究法呢基转移酶在原发性肝癌发生过程中的作用,为原发性肝癌的诊断与治疗提供一种新的方法。通过一系列的研究,建立和完善原发性肝癌的早期筛查手段,把法呢基转移酶作为一种更为敏感、简便、易行的肿瘤标志物。