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研究背景:骨质疏松症是一种退行性骨骼疾病,通常影响老年人群,尤其是绝经后妇女,并可能导致脆性骨折。为了保持适当的强度和完整性,骨骼经历不断的更新转换,使破骨细胞维持的骨吸收和成骨细胞引起的骨形成之间达到平衡。骨质疏松症是骨吸收超过骨形成的结果,其形态学特征是骨矿物质密度降低和小梁微结构破坏。骨质疏松症的发病机制受多种内源性和外源性因素的影响,包括衰老、体重相关的机械刺激、异常的矿物质和激素代谢以及与成骨基因的转录表达改变。最近的研究表明,表观遗传修饰异常参与控制破骨细胞生成和成骨细胞生成。DNA甲基化分析研究发现在骨质疏松症患者骨小梁中检测发现大量的基因组/基因被DNA甲基化修饰修饰,表明DNA甲基化在骨质疏松症发病进展中起着重要的作用。DNA甲基化是基因转录最稳定的表观遗传修饰之一,影响近60-90%的基因组。在哺乳动物中,三种生物活性的DNA甲基化转移酶（Dnmts）,即Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b,通过向基因启动子/增强子（CpG岛）中的CpG二核苷酸的胞嘧啶添加CH3甲基基团来催化DNA甲基化,从而阻断转录因子的进入并沉默目标基因转录。相反,DNA去甲基化是由（TET）家族通过氧化5mC为5hmC及其它中间体进而完成去甲基化过程。DNA甲基化是个可逆过程。DNA去甲基化药物在动物骨质疏松症实验研究中显示出治疗作用,但是它们的长期使用可能会对某些患者产生不可忍受的副作用。最近的研究发现,适当的体育锻炼如跑步能够在多种不同的生理和病理条件下有益地调节DNA甲基化,包括衰老、癌症及2型糖尿病等等。跑步运动简单易行,没有副作用,对保持骨骼健康和预防骨质疏松症有益,但是它的抗骨质疏松症作用是否涉及表观遗传机制及介导其抗骨质疏松症的关键基因还没有被实验证实。以往研究表明骨组织氧化应激反应能力下降与骨密度降低有因果关系,表明氧化还原失衡是骨质疏松症的诱发因素。Nrf2（核因子红系衍生2相关因子-2）基因转录子是宿主细胞调控氧化应激反应的主调蛋白,通常以无活性形式表达在几乎所有类型的细胞质中。在各种性质的应激刺激下,Nrf2从抑制蛋白Keap1中释放并转移到细胞核,与靶基因启动子上的抗氧化反应元件（ARE）结合,激活抗氧化和解毒基因的转录。Nrf2基因或病理性缺失的小鼠由于抗氧化应激能力不足对骨质疏松症的易感性增加。各种Nrf2激活剂或增强剂具有抗骨质疏松症保护作用。Nrf2启动子富含CpG岛,在与衰老相关的多种疾病如衰老、癌症和神经系统退行性疾病中呈现中启动子超DNA甲基化改变,伴随着Nrf2下调。我们推测由于DNA甲基化失调导致的Nrf2表观遗传性缺失可能参与骨质疏松症的发病或进展。本课题将以双侧卵巢切除（Ovx,Ovarectomy）诱导的骨质疏松症小鼠模型和骨质疏松症患者骨组织为研究对象,从以下几个方面研究骨质疏松症Nrf2缺失的表观遗传学机制,并探索跑步是否通过DNA甲基化调控作用缓解Nrf2缺失而发挥抗骨质疏松症。研究方法:1)构建小鼠双侧卵巢切除诱导绝经后骨质疏松症模型,并收集临床骨量正常和骨质疏松症患者股骨样本,提取股骨组织蛋白,确定Nrf2和DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达量的变化。2)测定骨量正常和骨质疏松症患者以及小鼠假手术对照组与双侧卵巢切除骨质疏松症小鼠的股骨组织标本中Nrf2启动子甲基化状态的变化。3)训练小鼠进行每天一小时跑步机运动锻炼,观察跑步运动锻炼对骨质疏松症小鼠骨量、Nrf2和DNMT表达量及其启动子区域甲基化状态的改善。4)比较跑步运动对对照组和双侧卵巢切除的野生型和Nrf2敲除小鼠骨量改善的差异,探究Nrf2是否是跑步运动抗骨质疏松症作用的关键介导蛋白/靶点。结果:1)Nrf2基因敲除小鼠双侧卵巢切除后加剧骨质疏松症,骨质疏松症患者和小鼠股骨中Nrf2表达下降,提示Nrf2缺或促进骨质疏松症的发生发展。2)骨质疏松症患者和小鼠股骨中Nrf2启动子超甲基化并伴有Dnmt1/3a/3b异常升高,表明Nrf2下调和DNA甲基化异常有关。3)小鼠每天一小时跑步机锻炼抑制Dnmt1/3a/3b异常高表达并缓解Nrf2启动子超甲基化。4)小鼠跑步机锻炼提升Nrf2表达水平并提升小鼠骨密度。5)小鼠跑步锻炼缓解Nrf2下游靶点抗氧化酶的表达抑制,提示跑步锻炼通过改善Nrf2表达提示了骨组织抗氧化应激能力。6)小鼠跑步锻炼对Nrf2野生型小鼠的抗抗骨质疏松症作用在Nrf2基因敲除小鼠明显减弱,表明Nrf2是介导跑步锻炼抗骨质疏松症的关键靶点。结论:众所周知,跑步能够改善骨质疏松症,但确切的保护机制不明。我们的研究表明,骨组织由于表观遗传DNA甲基化异常导致的Nrf2缺失以及抗氧化应激能力下降促发了骨质疏松症的发生发展,而DNA甲基化酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b异常高表达是造成Nrf2启动子超甲基化以及Nrf2表达缺失的直接原因。此外,跑步运动具有DNA甲基化调控作用,能够抑制DNA甲基化酶的异常表达,去Nrf2启动子超甲基化并逆转Nrf2表达下降,并通过提升Nrf2下游抗氧化应激酶表达增强骨组织的抗氧化应能力而改善骨密度。我们的研究结果揭示了骨质疏松症表观遗传学重要特征,调控通路和关键蛋白,为跑步防止或改善骨质疏松症提供了新的解释。