农杆菌介导AtCBF3及PaFT基因转化安祖花的研究

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安祖花(Anthurium andreanum Lind.)是一种重要的热带花卉,自引种栽培以来,其切花和盆花的需求量与日俱增。它以较长的花期,独特迷人的花枝,受到世界各地人们的喜爱。但其对温度较敏感,在温度较低的地域难以生长,限制了安祖花的推广,可见提高安祖花的抗寒性对其发展十分重要:另一方面,由于安祖花首次开花所需时间较长,使得育种周期延长,生产繁殖成本高,为安祖花的商业化生产带来了经济负担。因此在研究中可以使用基因工程的方法,用农杆菌介导法将AtCBF3、PaFT等相关基因转入安祖花中,实现品种改良。本研究在前人基础上,首先对安祖花再生体系进行了优化,并利用正交试验设计完善了遗传转化体系;然后,用拟南芥CBF3基因及悬铃木FT基因对安祖花不同基因型及取材部位的外植体进行了遗传转化,PCR检测结果显示得到了少量阳性植株。主要结果如下:1.优化了安祖花再生体系。结果表明:诱导愈伤组织的最佳培养基为1/2改良MSa+0.25 mg/L BA+0.14 mg/L KT+0.2 mg/L IAA,最佳基因型为‘冠军’,较优的取材部位为茎段,其诱导率最高可达96.7%;诱导不定芽的最佳培养基为改良MSa+0.01/0.1 mg/L TDZ,而‘粉冠军’的不定芽诱导能力显著高于‘红色甜心’诱导胚性愈伤组织的最佳培养基为改良MS3+1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+4%蔗糖+2%葡萄糖+0.25%Gel,最佳基因型为‘粉冠军’,较优的取材部位为叶片,胚性愈伤组织诱导率最高可达47.9%;胚状体发育的最佳培养基为改良MSa+2%蔗糖+0.25%Gel,其萌发率最高可达16.8%。2.抗生素敏感试验结果表明:愈伤组织分化时卡那霉素选择压确定为75 mg/L;潮霉素选择压确定为30 mg/L;头孢霉素第一次选择培养时使用400 mg/L,在后期培养中逐渐降低其浓度。3.通过正交实验设计及分析,发现较佳的遗传转化体系为:以安祖花茎段为转化受体,先进行预培养3d,农杆菌侵染时菌液浓度OD600值为0.4,侵染时间为20 min,25℃下共培养4d,共培养之后进行卡那霉素浓度为0-25-50-75 mg/L或者潮霉素浓度为0-10-20-30 mg/L的分步筛选,直至抗性芽的形成。再对抗性芽进行伸长(添加30 mg/L卡那霉素或15 mg/L潮霉素)、壮苗、生根(添加15 mg/L卡那霉素或5 mg/L潮霉素)等培养,直至完整的抗性植株出现。4.GUS染色结果表明:优化的遗传转化体系有较高的瞬间表达率,初步判断其能够有效地进行遗传转化,可以在后续实验中沿用。5.对不同基因型及取材部位的外植体进行了遗传转化,结果表明:转AtCBF3基因的外植体共获得了14株卡那霉素抗性植株,分别为‘罗宾奴’6株,‘粉冠军’3株,‘冠军’5株,经过PCR检测,‘粉冠军’和‘罗宾奴’分别得到1个阳性植株,转化率为0.13%;转PaFT基因的外植体获得了16株‘冠军’的潮霉素抗性植株,经过PCR检测,只有1个阳性植株,转化率为0.11%。
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