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气道重塑被认为是影响支气管哮喘发生发展的重要因素,可导致气道高反应性和不可逆气流受限,其主要病理改变包括杯状细胞增生、气道平滑肌增殖肥大、上皮下纤维化、气道壁新生血管增多等。其中,气道粘膜下和固有层新生血管增多作为气道重塑的重要组分,在慢性哮喘的早期就可出现,且与患者的病情严重程度有着明显的正相关关系。因而抑制哮喘气道新生血管形成对防治哮喘有重要意义。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞代谢和氧化还原的感受调节器,参与糖尿病、肥胖、心血管疾病、哮喘、肿瘤等多种疾病的发生。近年研究表明AMPK活性对血管平滑肌、内皮细胞及多种肿瘤细胞的生物特性发挥调节作用,可能通过抗氧化、抗炎、抗增殖等途径影响细胞功能。然而,AMPK活性变化与哮喘的发生和发展有何关系研究很少。二甲双胍(metformin,MET)作为AMPK的一种激动剂,通过抑制线粒体呼吸,使得AMP/ATP比值增加激活AMPK。本课题以二甲双胍为主要干预对AMPK在慢性哮喘小鼠气道炎症、重塑形成中的作用进行了探讨,并就其与内皮细胞增殖之间的关系及可能的分子机制进行了初步研究。目的⑴观察AMPK活化对慢性哮喘小鼠气道炎症、重塑及新生血管形成的影响。⑵了解慢性哮喘小鼠AMPK活化情况和二甲双胍干预后AMPK磷酸化情况。⑶初步探索二甲双胍激活AMPK对血管内皮细胞增殖的影响及其与细胞周期相关分子SKP2及P27的关系。方法和结果⑴采用卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏并激发制备慢性哮喘小鼠模型,给予二甲双胍(metformin)干预,与生理盐水对照组、慢性哮喘模型组相比,观察到二甲双胍能减少哮喘肺泡灌洗液细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比,降低外周血血清OVA特异性Ig E,抑制肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、TGF-β和MMP-9的表达。⑵慢性哮喘组病理染色可见气道壁炎症细胞浸润、杯状细胞增生、上皮下胶原沉积等病理改变;免疫组化示气道周α-SMA、MMP-9、TGF-β表达水平明显增加;二甲双胍组部分抑制了上述病理改变及其蛋白表达。⑶使用Elisa试剂盒检测外周血VEGF、s CXCR4、SDF-1表达水平,发现模型组较对照组升高,而二甲双胍可部分抑制其升高。免疫组化CD31染色观察到慢性哮喘组小鼠气道上皮下新生血管数目和面积增加;免疫荧光CD31染色也观察同样结果;二甲双胍组部分抑制新生血管的形成。⑷以肺组织Western Blot测定AMPK总量和磷酸化水平,发现慢性哮喘模型组p-AMPK/AMPK表达水平较对照组下降,二甲双胍干预后p-AMPK/AMPK表达水平升高;肺组织免疫组化p-AMPK染色观察到慢性哮喘模型组气道壁阳性表达较对照组下降,给予二甲双胍能阻止或减轻这种下降。提示慢性哮喘小鼠气道AMPK的活性受到抑制,二甲双胍可通过激活AMPK发挥上述作用。⑸采用二甲双胍激活AMPK,Compound C抑制AMPK信号通路,以明确激活AMPK能否抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖,并揭示其分子机制。免疫印迹法检测p-AMPK/AMPK、SKP2、P27蛋白水平。实验显示:二甲双胍激活AMPK后抑制SKP2表达,增加P27表达,进而抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖。这一作用具有剂量依赖性。结论⑴本实验研究了二甲双胍对小鼠慢性哮喘模型气道炎症及气道重塑的影响,研究表明二甲双胍减轻哮喘小鼠气道炎症、抑制粘液分泌、上皮下纤维化、气道平滑肌增厚及气道上皮下新生血管形成等气道重塑表现。⑵体外实验表明,二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路影响了细胞周期的正常进行,从而抑制内皮细胞的增殖和新生血管的形成。