随着抗生素的广泛应用甚至滥用,使得细菌对抗生素的耐药已十分严重,抗生素耐药性已经对人类健康造成巨大威胁。与此同时,抗生素正面临着投资巨大、开发缓慢、杀菌机制没有重大突破、相应耐药菌大量出现、耐药速度越来越快等问题。因此,急需开发具有新型杀菌机制的治疗剂或治疗手段。上世纪末人们发现了一类新型的抗菌活性物质——抗菌肽（Antimicrobial Peptides,AMPs）。AMPs是由基因编码、核糖体合成的一类内源性多肽,广泛分布于几乎所有生物体内,此外AMPs还具有以下几大优势:结构多样、杀菌机制新颖、易于获取、便于构效关系研究、不易产生耐药、能与抗生素协同作用等。目前,已有5000多种AMPs被收录,其中只有30多种AMPs处于临床研究阶段,这是由于AMPs对多种蛋白酶、温度、离子等因素敏感,增加了临床开发的难度和成本,因此能进入临床研究的AMPs也仅能用于糖尿病足、皮肤感染、痤疮等局部治疗中。多肽类和蛋白类物质对蛋白酶降解敏感是公认的,工业和食品加工中,为了提高多肽的稳定性采取了多种策略,包括:（1）环化。（2）固定化。（3）非天然氨基酸替换,包括高精氨酸、鸟氨酸、D-型氨基酸等。（4）订书肽引入。（5）轭合物构建。（6）二聚体构建。虽然多肽类物质增强稳定性的策略众多,但是这些策略是否适用于AMPs的稳定性提高尚不清楚。Cm-CATH2是我们实验室前期从绿海龟体内发现的一条含33个氨基酸残基,带13个正电荷,高级结构为两亲性α-螺旋,具有广谱高效抗菌活性、较强抗炎活性和抗生物膜活性的AMPs。本课题计划以Cm-CATH2为模板,用上述提高蛋白多肽稳定性的常用策略,对Cm-CATH2进行结构改造,对不同策略的改造效果进行比较,以期阐明何种策略适用于AMPs稳定性结构改造。Cm-CATH2结构改造及其改造体功能活性研究:以Cm-CATH2为模板通过N-端、C-端氨基酸删减法,设计了 20条改造体,分别命名为NCM1～10和CCM1～10。首先,我们选用了 10株革兰氏阴性菌和6株革兰氏阳性菌,通过最小抑菌浓度（Minimum Ihibitory Concentration,MIC）检测的方法测定了它们的抗菌活性。结果显示,NCM1～7和CCM1～7均较好的保留了亲本肽的抗菌活性。然后用MTT法检测了它们对4T1细胞、HaCaT细胞、B16-F10细胞和MPMs细胞的毒性。结果显示,CCM1～10除了对HaCaT细胞表现出了较弱的细胞毒性外,对其余三株细胞均表现出了较强的毒性。总体上CCM1～10的细胞毒性比NCM1～10的要强,尤其是CCM1～8能杀死60%-90%的细胞。而NCM1～10中,NCM1～3表现出了较强毒性。最后检测了它们的抗炎活性,LPS是细菌细胞膜上的脂多糖,能诱导细胞和机体产生炎症反应,引起炎症因子TNF-α、IL-6等的高表达,有抗炎活性的多肽能抑制这些细胞因子的高表达。实验结果显示,单独的改造体多肽处理细胞后,细胞的炎症因子表达正常,而LPS刺激细胞后用改造体多肽处理,NCM1～10、CCM1～6均能显著抑制TNF-α的高表达,NCM1-4、CCM1～7均能显著抑制IL-6的高表达。综合考虑抗菌活性、细胞毒性和抗炎活性,我们最终选择NCM4作为下一步稳定性结构优化的模板。以毒性最小活性较强的NCM4为模板,进行第二步提高稳定性的结构改造,改造方法如下:一、非天然氨基酸高精氨酸和鸟氨酸替换肽链中的精氨酸和赖氨酸,这种改造不改变AMPs的高级结构构象。二、非天然氨基酸D-型氨基酸替换肽链中的天然L-型氨基酸,dNCM1是全D-型氨基酸替换,dNCM2是D-型精氨酸和赖氨酸换肽链中的L-型精氨酸和赖氨酸,这种改造改变了 AMPs的高级结构构象。三、环化设计,在肽链不同位点插入一对半胱氨酸,通过二硫键环化多肽。四、在不同位点引入α-甲基和α-烯基,通过复分解反应生成订书肽（stapled peptides,stAMPs）。然后进行胰酶稳定性和血清稳定性验证。结果显示,通过AMPs与胰酶共孵育后,仅oNCM、hNCM、dNCM1、dNCM2表现出了较强的稳定性,NCM4和dsNCM1表现出了中等的稳定性。其余环化肽和订书肽胰酶稳定性较低,与胰酶共孵育6h内均被降解。血清稳定性结果与胰酶稳定性实验结果基本一致,订书肽与血清共孵育后,对大肠杆菌和黄色葡萄球菌的抗菌活性明显减弱,环化肽在血清中较胰酶中稳定,而非天然氨基酸替换肽在血清中也很稳定。然后对这些稳定性多肽改造体进行了抗菌活性、细胞毒性和抗炎活性研究。抗菌结果表明,订书肽抗菌活性最好,除了 stNCM8以外其余订书肽对革兰氏阴性菌和阳性菌的MIC值均在4.69～37.5 μg/mL之间,而非天然氨基酸替换肽和环化肽对革兰氏阴性菌的活性较强,对革兰氏阳性菌的活性显著减弱（MIC值均大于100μ/mL）。用MTT法检测了15条稳定性改造体多肽对HaCaT和Raw 264.7两株细胞的细胞毒性。结果表明,订书肽细胞毒性最强,而非天然氨基酸替换肽和环化肽毒性较弱。溶血活性结果也显示订书肽溶血率最高,非天然氨基酸替换肽和环化肽溶血率较低。用ELISA试剂盒检测了它们的抗炎活性,除了 dNCM1、dsNCM1、2、5之外,其余稳定性改造体多肽均表现出了显著的抗炎活性。综上所述,我们最终选择稳定性最好,细胞毒性最小和抗炎活性最强的3条稳定性多肽改造体oNCM、dNCM2、dsNCM1作为代表,进行后续体内外活性和机制研究。第三步我们对优选的稳定性改造体多肽oNCM、dNCM2、dsNCM1以及其亲本NCM4进行了体外抗菌、抗炎和抗生物膜实验,使用圆二色谱法检测了其它们在SDS模拟的疏水性环境中的二级结构,过NPN、PI和SEM实验研究了它们的抗菌机制,然后验证了它们对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的耐药性诱导能力。结果显示,这4个多肽尽管对革兰氏阳性菌活性微弱,但对革兰氏阴性菌基本保留了亲本肽的优势抗菌机制结果证明,这4个多肽都能破坏细菌的细胞内膜和外膜。我们猜测这些优化肽的杀菌机制之一是破坏细菌细胞膜,使内容物泄露从而起到杀菌作用。抗炎活性结果表明,4个多肽的抗炎活性相当,都能显著的抑制由LPS诱导的TNF-α和IL-6的表达。耐药性诱导实验结果表明,oNCM能诱导大肠杆菌产生耐药,其余多肽对大肠杆菌没有耐药性诱导效果,而鲍曼不动杆菌对4个多肽都没有耐药性。最后我们建立了小鼠腹膜炎模型,实验结果显示未治疗组小鼠在鲍曼不动杆菌感染12 h内均死亡,而dNCM2稳定性改造体组小鼠在24 h后全部死亡,其余多肽处理组小鼠的存活率均与阳性对照美罗培南组相似,达到了 50%,且这些组别小鼠的存活时间明显比未处理组延长。而腹腔和内脏菌落计数结果显示,dNCM2和dsNCM1多肽处理组小鼠体内的菌落数均较其他组大,但是所有处理组小鼠体内的菌落数均较未处理组少2～4个数量级。动物实验结果并没有比较出3个优选改造体多肽同NCM4之间的优劣,可能是因为我们的动物模型选择不当,后期我们将多建几个动物模型,如皮肤脓肿模型、皮肤创伤模型和小鼠肺部感染模型等,进行进一步比较和研究,得出稳定性优选肽同NCM4之间的优劣。本课题研究结果表明,订书肽除了能提高抗菌活性和抗菌谱之外,表现出了较强的细胞毒性和溶血活性,很弱的酶稳定性和血清稳定性。因此,订书肽改造的策略不宜被用于高剂量给药的多肽和哺乳动物体内给药的多肽。D-型氨基酸替换能明显提高抗菌肽的酶稳定性和血清稳定性,细胞毒性较低,但是抗菌活性略微减弱,适合用于具有高活性AMPs的稳定性改造。环化多肽的毒性较低,抗菌活性略微减弱,但是酶和血清稳定性会因二硫键的位置不同而有差异,但是环化肽总体上对胰酶和血清的抵抗力很弱。高精氨酸和鸟氨酸替换能提高酶稳定性,降低细胞毒性,同时不显著改变抗菌活性。