研究背景糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）属于一种常见的糖尿病并发症,被定义为视网膜内微血管的永久性损伤,最终导致视网膜严重受损或视力丧失,极大地降低了糖尿病患者的生活质量。糖尿病患者中发生DR的人数逐年增加,目前的治疗手段包括激光光凝、玻璃体注射药物和玻璃体切除,这些治疗方法均属于侵入性的手段,仅仅是治标的方法,只可能暂时性地缓解症状,而得不到明显的临床意义上的改善。因此,迫切需要开发新的治疗方法以解决临床治疗中的难题。在DR的整个发展过程中,不同的视网膜细胞受到慢性损伤,并不断累积和加重,而细胞损伤原因最常见的是持续的高血糖、活性氧（Reactiveoxygen species,ROS）引起的氧化应激,以及炎症反应,最终导致视网膜血管和周围组织的细胞凋亡。视网膜色素上皮细胞是组成血-视网膜外屏障的视网膜细胞之一,并参与维持视网膜稳态。由于其没有再生能力,视网膜色素上皮细胞的异常会导致许多眼部疾病。高血糖状态引起不同的视网膜细胞损伤积累从而导致DR是广为认同的病理过程。许多研究表明高浓度葡萄糖会引起细胞活力下降,ROS产生增多,释放炎症因子等病理变化,引起细胞的损伤和凋亡。因此,抑制ROS积累和抑制高糖诱导的细胞凋亡可以在治疗DR时起到极其重要的作用。寻找有效的中医药防治手段,将为DR的防治开辟新的途径。黄芪具有利水消肿、补气固表、健脾补中的作用,药用历史达两千多年,是一种药用价值很高的传统中药。黄芪含有多种活性成分,包括黄芪皂苷、黄芪多糖和异黄酮,而黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）是从黄芪中分离的黄酮类化合物。AS-Ⅳ是一种黄芪中重要的生物活性成分,具有明显的药理活性,包括抗炎、免疫调节、抗氧化、保护缺血、抑制氧化应激、增强机体免疫力、抗病毒、改善心肺功能、作为促生长剂、抗衰老、抗疲劳等,也有研究表明,AS-Ⅳ可以通过调节炎症基因表达和抑制炎症细胞因子成熟来显著减少炎症浸润。AS-Ⅳ对多器官系统发挥多样的药理作用。有研究指出糖尿病视网膜病变过程涉及到氧化应激损伤。氧化应激参与生理和病理过程,以及疾病的发生和发展。值得注意的是,氧化应激与多种介质有关,导致进一步的组织损伤而引发多种疾病。因此,着眼于氧化应激与疾病之间的关联,已有许多研究将AS-Ⅳ作为抗氧化应激分子工具,探讨了防治相关疾病的多种药理作用。AS-Ⅳ可治疗多种糖尿病并发症,如糖尿病肾病、糖尿病心肌病及糖尿病酮症酸中毒等。已经有研究发现AS-Ⅳ对糖尿病小鼠的糖尿病视网膜病变有一定的抑制作用,提示AS-Ⅳ可能从抑制抗氧化应激的反应上对DR产生治疗作用。实验目的利用网络药理学和分子对接预测AS-Ⅳ治疗DR的可能靶点。再通过细胞水平上的实验对分子机制进行初步探索。实验方法利用Swiss Target Prediction和Targetnet数据库平台筛选出AS-Ⅳ的潜在作用靶点,随后在人类基因数据库、在线人类孟德尔遗传数据库和药物靶标数据库中检索DR的相关靶点。将AS-Ⅳ潜在靶点和DR相关靶点进行重合分析,所得到的交集靶点即为AS-Ⅳ治疗DR可能的作用靶点。随后进行蛋白相互作用网络建立、基因本体论、京都基因与基因组百科全书通路富集分析。最后使用Autodock Vina软件进行分子对接验证。用不同浓度额外添加葡萄糖 10mmol·L-1、30mmol·L-1、50mmol·L-1、70mmol·L-1和200 mmol·L-1的培养基培养人视网膜色素上皮细胞（Human retinal pigment epithelial cells,ARPE-19）24h和48h,用CCK-8检测细胞活力,确定高葡萄糖损伤ARPE-19细胞的合适时间和最佳浓度;使用不同浓度AS-Ⅳ（5、10、20 μ mol·L-1）预处理细胞,确定AS-Ⅳ保护细胞的最佳浓度和时间。通过细胞核染色,判断细胞核损伤;检测细胞产生的ROS,判断氧化应激损伤状态;利用试剂盒检测细胞内的SOD、CAT、GSH、GSH-Px和LDH来探究AS-Ⅳ对高葡萄糖损伤ARPE-19细胞引起氧化应激等损伤的抑制作用。结合网络药理学和分子对接结果,最后进行机制探索。使用Western Blot法检测抗氧化相关蛋白HO-1和NRF-2的表达及PI3K/Akt通路中的p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β的表达,对凋亡通路中的相关蛋白 Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved caspase-9进行检测,来探索AS-Ⅳ保护ARPE-19细胞免受高糖损伤的分子机制。实验结果1.网络药理学分析结果发现,AS-Ⅳ和DR的交集靶点56个,经过蛋白相互作用网络分析获得排名前5位的关键靶点:蛋白激酶B1（Aktl）,血管内皮生长因子A（VEGFA）,表皮生长因子受体（EGFR）,非受体酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）,信号转导和转录激活因子3（STAT3）。通过分子对接分析,验证了黄芪甲苷与这5个关键靶标受体具有较强的结合亲和力,即AS-Ⅳ对DR发挥治疗作用,可能是与这些关键靶点进行结合。2.用荧光显微镜进行ROS染色荧光拍照。对照组细胞呈现微弱的绿色荧光,而高糖处理提高了细胞的氧化应激水平,绿色荧光增强。3.用荧光显微镜对细胞核进行Hoechst 33342荧光染色观察发现,AS-Ⅳ能够缓解高糖引起的细胞核受损而导致的形态上的改变。4.利用试剂盒对细胞内SOD、CAT、GSH、GSH-Px和LDH的检测来探究AS-Ⅳ对高葡萄糖损伤ARPE-19细胞引起氧化应激的抑制作用,AS-Ⅳ预给药能后,能够显著提高SOD活力、GSH含量、CAT活性、GSH-PX活性,还减少了细胞中乳酸脱氢酶的释放。表明AS-Ⅳ能够抑制高糖诱导的ARPE-19细胞抗氧化能力的降低。5.检测线粒体膜电位时发现,AS-Ⅳ可能会稳定线粒体膜电位。6.使用Western blot法检测蛋白分子变化,发现AS-Ⅳ通过上调Nrf-2转录因子的表达,然后增加HO-1抗氧化蛋白的表达来抵抗高糖诱导的ARPE-19细胞的氧化应激。在AS-Ⅳ预处理的组,p-PI3K/PI3K的比值会进一步上升,与HG组有显著性差异,其下游蛋白p-Akt、p-GSK-3β蛋白含量的表达增加,调节细胞存活。同时,AS-Ⅳ预处理可以显著性抑制高糖处理导致Bcl-2/Bax的比值下降和细胞色素C释放,也可以抵抗高糖损伤引起的cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9比值上升,即抑制Caspase的级联反应,从而抑制线粒体凋亡通路的开启。研究结论AS-Ⅳ的潜在靶点与糖尿病视网膜病变的相关靶点高度相关,表明黄芪甲苷可能通过Aktl、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3等关键靶点,作用于氧化应激、血管新生、炎症等信号传导通路,发挥治疗DR的作用。在高糖损伤的ARPE-19细胞模型中,AS-Ⅳ表现了对ARPE-19细胞氧化应激状态的抑制作用。AS-Ⅳ明显减少高糖引起的ARPE-19细胞中ROS的产生,对ARPE-19细胞中的4种抗氧化物质SOD、GSH、CAT、GSH-PX的活力和含量有所增益。此外,Western Blot结果表明,AS-Ⅳ通过上调Nrf-2转录因子的表达,然后增加HO-1抗氧化蛋白的表达来抵抗高糖诱导的ARPE-19细胞的氧化应激;AS-Ⅳ预给药后增加了 p-Akt蛋白含量的表达,说明AS-Ⅳ可能通过积极调解Akt磷酸化来调控细胞应对氧化应激,AS-Ⅳ可能通过PI3K/Akt-NRF-2信号通路来保护ARPE-19细胞。此外,AS-Ⅳ预处理可以显著性抑制高糖处理导致Bcl-2/Bax的比值显著下降和细胞色素C释放量降低,抑制Caspase的级联反应来保护ARPE-19细胞。