【摘 要】
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为了加快NGF在中枢神经及外周神经损伤和退行性变治疗作用中的研究,我们首先建立hNGF β成熟区蛋白基因片段克隆和NGF β的基因克隆.使用原核表达技术获得基因工程的重组hNGF
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为了加快NGF在中枢神经及外周神经损伤和退行性变治疗作用中的研究,我们首先建立hNGF β成熟区蛋白基因片段克隆和NGF β的基因克隆.使用原核表达技术获得基因工程的重组hNGF β原核表达蛋白.经蛋白质的粗纯和亲和层析纯化后,使用鸡胚背根神经节突起生长试验和PC12细胞BrdU掺入实验检测了表达蛋白的生物活性.使用重组病毒技术,构建了插入hNGF β基因的重组腺伴病毒穿梭质粒,包装了具有感染能力的NGF β重组腺伴病毒.使用该病毒感染NIH 3T3细胞建立表达NGF β的哺乳动物细胞株.纯化了真核细胞表达的NGF β并检测了生物活性,比较原核和真核细胞表达NGF β的产量、生物活性差异.为使用基因重组技术表达高生物活性的NGF β提供依据,为NGF β的基因治疗脊髓和周围神经损伤奠定基础.结论1.我们成功的建立了人NGFβ的基因克隆和编码NGFβ成熟蛋白区的DNA片段克隆,虽然该克隆中57nt处存在一个核苷酸变异,但它同GenBank数据库中人NGF β编码蛋白氨基酸序列完全相同.2.将NGF β成熟区DNA片段插入到原核表达载体,表达了NGF β蛋白,经蛋白复性,纯化后测定每升表达菌可获得1.8-2.0mgNGF β,其生物活性为1×10<,5>.BU.g<-1>.3.将人NGF β基因插入到重组腺伴病毒穿梭质粒,构建了NGF β重组病毒载体.使用NGF β重组腺伴病毒穿梭质粒,腺伴病毒辅助质粒和含有野生2型腺病毒全基因组质粒共转染293包装细胞,构建了表达NGF β的重组腺伴病毒.通过斑点杂交定量实验证实包装的重组病毒滴度可达1×10<11>pfu/ml.4.使用该病毒感染NIH 3T3建立长期表达人NGF β的哺乳动物细胞株.感染重组病毒的NIH3T3细胞培养基上清,经浓缩、肝素亲和层析可以获得纯度大于95％的NGF β蛋白,每升细胞培养基中可以获得400-500ugNGF β蛋白,生物活性为1×10<8>.BU.g<-1>.5.原核表达NGF β的产量高,生物活性低,真核表达NGF β产量低,生物活性高.
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