背景HIV等血源性职业暴露感染和医源性感染是广大医务人员、公安司法干警和公众最关心的问题之一。传统的HIV暴露后感染溯源主要依赖于流行病学调查。国外有报道将分子流行病学技术用于HIV暴露后感染溯源调查,通过对可疑传播链上不同个体体内HIV准种群(quasispecies)的基因高可变区核酸序列进行分析,为HIV职业暴露感染鉴定、医源性感染调查、司法调查等提供分子实验室依据。溯源研究的方法主要有三种,分别是巢式PCR产物直接测序法、巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法。巢式PCR产物直接测序法可以获得优势准种的序列,但弱势准种序列难以被检出。而巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法则可以同时获得优势准种和部分弱势准种,提供更多的准种序列信息用于溯源分析。本文分别建立了巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法两种基于准种分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,并用于调查一起疑似输血感染HIV案例,为HIV传播的流行病学调查提供分子实验室证据,探讨了两种方法的适用性。目的1、建立两种基于准种分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,分别是巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法；2、将建立的两种方法分别用于一起疑似输血感染HIV案例的溯源分析；3、探讨不同样品类型(全血、血浆)对单基因扩增法检测结果有无影响。材料和方法1、采集可疑传播链上3例HIV感染者(编号T1-T3)及作为对照的13例已知HIV感染者或艾滋病患者(编号C1-C13)血样。2、利用巢式PCR产物克隆法进行溯源研究先从采集的血浆样品中提取RNA,然后对RNA进行逆转录巢式PCR扩增,挑选扩增成功的产物进行克隆,获取准种,测序后获得准种序列,对准种序列进行系统进化树分析。3、利用单基因扩增法进行溯源研究3.1血浆样品1)从血浆样品中提取RNA；2)将RNA逆转录为cDNA;3)将cDNA进行梯度稀释,摸索最佳稀释度；4)根据最佳稀释度进行96孔巢式PCR反应；5)对扩增成功的孔进行测序,获得的准种序列进行系统进化树分析。3.2全血样品1)分别从全血样品中提取全核酸；2)将全核酸逆转录为cDNA和前病毒DNA；3)将cDNA和前病毒DNA进行梯度稀释,摸索最佳稀释度；4)以下步骤同血浆样品。结果1、巢式PCR产物克隆法结果1)在16份样品中,成功扩增出13份的核酸目的片段。最终获得59个克隆的核酸序列,大部分克隆间的核酸序列不同。2)对克隆的核酸序列进行基因离散率分析：大部分样品内不同克隆间的平均基因离散率小于3%；分析T1与其它样品间的基因离散率,与T2、T3、C12的基因离散率要小于与对照样品间的基因离散率。因此提示T1、T2、T3和C12应具有传播关系。3)对克隆的核酸序列进行系统进化树分析：T1、T2、T3和C12的所有克隆及C13的2个克隆聚为一簇,分支处自展(bootstrap)值为100%；T3部分克隆与T1、T2、C12聚为一簇,T3相对于T1、T2、C12来说应当是并系关系,在分子实验室方面T3为T1、T2、C12的传染源。2、单基因扩增法结果2.1血浆样品1)在16份样品中,血浆样品成功扩增出15份的核酸目的片段,获得153个准种序列,大部分准种间的核酸序列不同。2)对准种的核酸序列进行基因离散率分析：大部分样品内不同准种间的平均基因离散率小于4%；分析T1与其它样品间的基因离散率,与T2、T3、C12的基因离散率要小于与对照样品间的基因离散率。因此提示T1、T2、T3和C12应具有传播关系。3)对准种的核酸序列进行系统进化树分析：T1、T2、T3和C12的所有准种聚为一簇,分支处自展(bootstrap)值为94%；T3部分准种与T1、T2、C12聚为一簇,T3相对于T1、T2、C12来说应当是并系关系,在分子实验室方面T3为T1、T2、C12的传染源。4)对照样品C5与C6进行系统进化树分析,结合流行病学资料,判定C5为C6的传染源。2.2全血样品1)在16份样品中,全血样品成功扩增出14份的核酸目的片段,获得153个准种序列,大部分准种间的核酸序列不同。2)在判定C2与C4的关系时,血浆样品和全血样品得到的结果不同,全血样品获得的准种可以得到C2为C4的传染源的分子实验室证据而血浆样品却无法得到。除此之外,全血样品与血浆样品结果一致。3、两种方法的比较两种方法分别进行HIV暴露后感染溯源研究时分析结果一致。研究结果显示在亚型分型时,巢式PCR产物克隆法得到的结果在判定对照样品C8时,仅能判定其为BC亚型,而单基因扩增法可得到C8样品为07-BC亚型的结果。结论1、建立了基于准种分析的两种HIV暴露后感染溯源检测方法：巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法。2、将巢式PCR产物克隆法和单基因扩增法分别用于一起疑似输血感染HIV案例的溯源分析,实验结果支持HIV从T3经T2传播到T1的流行病学调查线索,显示分子流行病学技术可以为HIV暴露后感染溯源调查提供更直接的证据。两种方法的检测结果一致。3、在HIV暴露后感染溯源研究中,单纯实验室检测数据不能判定传播关系,需与流行病学资料相结合使用。4、利用单基因扩增法溯源分析时,对于感染时间较长的感染者,使用全血样品比使用血浆样品得的准种信息更多。