骨关节炎是一种极为常见的慢性退行性关节疾病,而年龄则是其最重要的危险因素。软骨细胞代谢紊乱及炎性作用是细胞衰老和骨关节炎（OA）的主要病理改变。近期研究表明,年龄相关的线粒体功能障碍可能是导致OA发展的关键因素。线粒体融合蛋白2（MFN2）是线粒体融合、细胞代谢、细胞自噬及凋亡的重要调节蛋白,但其在OA中的作用目前尚未明确。这项研究是为了明确MFN2是否参与软骨细胞衰老及骨关节炎的发生,首先研究了MFN2在软骨衰老及骨关节炎中的表达情况,然后应用siRNA及病毒等工具研究调控MFN2表达研究其对细胞代谢功能的影响,并进一步研究调控MFN2对细胞炎症调控及OA进展的影响,探讨软骨细胞衰老及OA发生发展的病理机制,为OA寻找新的治疗靶点。本研究共分为以下四部分:1.MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况2.MFN2对软骨细胞代谢功能的影响3.MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对炎症的调控作用4.MFN2表达异常的调控机制第一章MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况目的:探究MFN2在老化与OA过程中软骨组织内的表达情况研究方法:临床样本收集于浙江大学医学院附属第二医院骨关节病区接受全髋关节、全膝关节置换手术的患者术后废弃的髋膝关节软骨,其中,年轻组取自6名患有股骨头坏死的女性患者,年老组取自6名患有股骨颈骨折的女性患者。OA组取自经全膝关节置换术后的膝关节OA患者其膝内侧软骨磨损区,而对照组则取其外侧软骨完整区。动物样本取自3周、5月、12月的Sprague Dawley大鼠的膝关节。通过Western-blot、免疫荧光等方法检测软骨中MFN2的表达情况。结果:对临床样本的检测显示,人老年软骨中MFN2的蛋白表达水平高于来自性别匹配的股骨颈骨折患者的关节软骨（P<0.05）,人OA软骨内侧磨损区中MFN2的蛋白表达水平也高于其外侧完整区（P<0.05）。组织免疫荧光结果也显示,人老年软骨中MFN2的表达水平显著高于来自性别匹配的股骨颈骨折患者的关节软骨,人OA软骨内侧磨损区中MFN2的蛋白表达水平也显著高于其外侧完整区。结论:MFN2在衰老过程以及骨关节炎中表达显著升高。第二章MFN2对软骨细胞代谢功能的影响目的:探究MFN2对软骨细胞代谢功能的影响研究方法:分别提取3周龄、5月龄、12月龄SD大鼠关节软骨细胞用于体外实验,应用siRNA转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰软骨细胞内MFN2的表达。通过Western-blot检测软骨细胞中MFN2的干扰效率及其他表达指标的改变影响,分别进行糖吸收试验、氧耗率检测试验、ATP检测试验、线粒体ROS检测试验比较不同年龄来源的大鼠软骨细胞以及有无siRNA干扰下的大鼠软骨细胞的细胞代谢功能的变化情况。结果:Western-blot检测结果显示,siRNA转染后能显著降低MFN2的表达,同时,对细胞增殖相关蛋白P16、P21,抗氧化蛋白NRF2、SOD2无明显影响;糖吸收试验显示,软骨细胞糖吸收的含量随年龄增高而下降,siRNA转染后可有所上升;氧耗率检测试验显示,软骨细胞基础氧耗率及最大氧耗率随年龄增高而增大,siRNA转染后会明显下降;ATP检测试验显示,软骨细胞ATP含量随年龄增高而下降,而siRNA转染后亦明显降低;线粒体ROS检测显示,软骨细胞线粒体ROS含量随年龄增高而逐渐增高,siRNA转染后出现明显下降。结论:软骨细胞随着年龄升高会使得其糖酵解代谢下降,线粒体呼吸水平上升,线粒体ROS水平上升。敲降MFN2可以明显逆转这一变化。第三章MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对炎症的调控作用目的:研究OA中过表达/敲降MFN2在大鼠体内体外骨关节炎模型中对骨关节炎炎症的调控作用。研究方法:在体外实验部分,应用慢病毒包装MFN2过表达/敲降质粒转染体外培养大鼠软骨细胞,过表达/敲降软骨细胞中的MFN2的表达水平。通过Western-blot检测软骨细胞中MFN2的过表达/敲降效率以及在有无IL-1β诱导炎症情况下COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平的表达情况,同时进一步检测IL-1β诱导后NF-κB通路的核心蛋白P65的磷酸化程度以及IKBα的磷酸化程度及降解情况。在体内实验部分,我们运用内侧半月板切除术（DMM）对大鼠的膝关节进行OA造模,分别于术前一周、术后一周、三周、五周时接受慢病毒关节腔注射。体内实验共分为5组:Sham组为假手术组,仅打开关节腔不切除半月板便缝合关节腔,不接受病毒注射;Lenti-OE组为过表达组,注射MFN2过表达病毒;NC-OE组为过表达对照组,注射过表达对照病毒;Lenti-KD组为敲降组,注射MFN2敲降病毒;NC-KD组为敲降对照组,注射敲降对照病毒。造模8周处死动物,取其膝关节进行SO染色及免疫组化检测。免疫组化检测MFN2过表达/敲降情况及炎症指标COX2、MMP13的表达情况。结果:体外结果显示,MFN2过表达病毒转染后能显著提高IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平,并能显著降低IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COL2的蛋白水平,MFN2敲降病毒转染后则显著降低IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COX2、INOS、MMP9、MMP13、COL2的蛋白水平,并能显著提高IL-1β诱导24h后大鼠软骨细胞中COL2的蛋白水平。同时,MFN2过表达病毒转染后能显著提高IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中P-P65、P-IKBα的蛋白水平,并能显著降低IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中IKBα的蛋白水平,MFN2敲降病毒转染后则显著降低IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中P-P65、P-IKBα的蛋白水平,并能显著提高IL-1β诱导10min后大鼠软骨细胞中IKBα的蛋白水平。体内结果显示,过表达MFN2后软骨退变程度较对照组更为严重,COX2、MMP13表达更多,而敲降MFN2后软骨退变程度较对照组减轻,COX2、MMP13表达降低,与体外试验结果相一致。结论:MFN2会促进关节炎的炎症反应,敲降MFN2可以延缓关节炎的进展。第四章MFN2表达异常的调控机制目的:研究MFN2表达异常的调控机制研究方法:分别提取3周龄、5月龄、12月龄SD大鼠关节软骨,通过RT-PCR检测各月龄软骨中MFN2的表达情况。而后再提取OA造模组及其sham对照组大鼠关节软骨,通过Western blot技术检测各月龄软骨及OA软骨中MFN2和PARKIN的表达情况。应用siRNA转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰软骨细胞内PARKIN的表达,检测siRNA干扰对MFN2表达的影响。最后通过免疫共沉淀技术检测正常软骨细胞中MFN2和PARKIN是否存在互作关系,以及两者表达与泛素蛋白的结合关系。结果:不同月龄SD大鼠关节软骨中MFN2的mRNA水平并无明显差异。而MFN2的蛋白水平则随着月龄升高而增加,OA组织表达也高于正常组织;相对地,PARKIN的蛋白水平则随着月龄升高而降低,OA组织表达也低于正常组织。经siRNA敲降PARKIN可以明显上调MFN2的表达。细胞免疫共沉淀检测可以证明两蛋白在生理状态下存在互作关系,且敲降PARKIN后可以明显降低MFN2的泛素化水平。结论:MFN2的表达异常与PARKIN的表达下调有关。