野生茄子托鲁巴姆黄萎病抗性相关基因StoVel功能鉴定

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黄萎病是一种危害性很大的植物维管束病害,严重影响着番茄、茄子、棉花、马铃薯等重要农作物的产量和品质。选育抗黄萎病的新品种,是控制植物黄萎病危害的最好途径。可是,在现有的栽培品种中,抗病基因严重缺乏,从野生茄子Solanum torvum中克隆黄萎病抗性相关基因,并转化植物,对植物黄萎病抗病育种具有重要意义。   根据本实验室克隆的抗黄萎病相关基因StoVel的cDNA序列,设计引物,获得全长,构建表达载体pCAMBIA1304-StoVel,通过农杆菌介导的遗传转化方法将StoVe1基因转化到马铃薯和烟草基因组中。   主要研究结果如下:   马铃薯Désirée遗传转化。以茎段为外植体,获得了25个潮霉素抗性株系,PCR检测,有12株为阳性,其中10株表现为GUS染色阳性。基因表达分析表明,转基因株系C9、C17和C24中StoVe1基因表达量高于野生型对照,是其5~9倍。提取马铃薯植株粗蛋白进行体外抑菌实验,转基因株系C9、C17和C24蛋白提取物均明显抑制Verticillium dahliae的生长。对这三个转基因马铃薯株系进行V.dahliae侵染实验,结果显示,与对照相比,三个转基因马铃薯株系表现出不同程度的抗性,其病情指数和发病率均低于对照。   烟草NC89遗传转化。以叶片为外殖体,共得到了12个烟草抗性株系,7株表现为PCR阳性,选取三株转基因烟草T14、T11和T7,qRT-PCR分析显示,转基因株系StoVe1基因表达量均比对照高,为对照的2-6倍,提取叶片总蛋白粗提液,进行体外抑菌试验,结果表明,转基因烟草具有显著的抑菌效果。   为了研究茄科种属间Ve1基因的同源关系,从野生茄子托鲁巴姆中克隆了StoVe1基因DNA序列及苏崎茄,马铃薯和烟草中Ve1基因DNA中间片段序列。SMART软件在线分析显示,Stovel具有15个亮氨酸重复序列(LRR),富含LRR是抗病相关蛋白的特征之一。托鲁巴姆、马铃薯和烟草中间片段都含5个LRR,而苏崎茄含4个。通过NCBI在线进行氨基酸序列比对(Blastp)显示,托鲁巴姆Ve1基因与其它茄科植物一致性最高。选取具有代表的Ve氨基酸序列构建Ve蛋白的系统进化树,马铃薯和烟草在同一簇内,一致性较高,苏崎茄和托鲁巴姆的遗传距离可能与抗黄萎病能力差异有关。
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