论文部分内容阅读
鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)感染引起的一种危害严重的禽类免疫抑制性疾病,给全球范围内的家禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而目前对CIAV感染及其诱导的免疫抑制的致病分子机理知之甚少,在CIAV基因组编码的三个蛋白VP1、VP2及VP3中,衣壳结构蛋白VP1被认为在介导CIAV感染宿主细胞及诱导产生中和抗体中具有极其重要作用,VP2编码双功能型磷酸酶活性,而VP3则编码凋亡素。CIAV的VP1是如何与易感细胞表面受体结合启动病毒感染及其分子基础尚需进一步探究。本研究在成功分离鉴定到一株CIAV毒株及进行全基因测定分析的基础上,对CIAV的VP1基因进行了克隆表达及稳定表达细胞系构建,且以合成多肽表位为免疫原研制出了 5株抗CIAV的VP1蛋白特异性单克隆抗体。研究结果为进一步开展CIAV分子流行病学调查、创制CIAV诊断技术、鉴定CIAV感染细胞受体及解析VP1介导的CIAV感染分子机制等提供了材料,打下了基础。1.鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ株的分离鉴定及其遗传演化分析为对江苏某地区疑似鸡传染性贫血病例进行病原检测与鉴定,将病料进行了PCR检测以及MDCC-MSB1细胞接种与盲传。PCR结果表明病料以及MDCC-MSB1细胞盲传物中均能扩增出CIAV特异性条带。证明已成功分离到一株CIAV,将其命名为CIAV-JS-CZ。通过设计3对引物对CIAV-JS-CZ分离株进行全基因测序,并借助生物学软件对基因组序列和生物信息学进行分析。结果表明,CIAV-JS-CZ分离株全基因组大小为2298bp;CIAV-JS-CZ分离株与23株国内外的CIAV分离株核苷酸的同源性在96.1%-99%之间,其中与日本分离株(AH9410)同源性高达99%,与我国广东分离株(GD-K-12)同源性最低,为96.1%;CIAV-JS-CZ分离株VP1的第394位氨基酸为谷氨酰胺(Q),提示该分离株可能具有较强致病性。鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ毒株的分离鉴定丰富了 CIAV毒株数据库,为进一步开展CIAV研究打下了基础。2.鸡传染性贫血病毒VP1基因克隆及其表达细胞系初步构建为探究VP1在CIAV介导感染中作用及鉴定其潜在宿主互作蛋白,本研究以CIAV-JS-CZ的基因组为模板,首先PCR扩增出CIAV的VP1全基因ORF,并经酶切连接后克隆进真核表达载体pcDNA3.1-Hygromycin。重组质粒经测序验证后,命名为pcDNA3.1-Hygromycin-VP1。利用抗CIAV的VP1特异性多克隆抗体进行的间接免疫荧光试验证明,转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1的293T细胞可见特异性亮绿色荧光,而转染对照载体pcDNA3.1-Hygromycin的293T细胞中未见特异性亮绿色荧光。由于课题组观察到LMH细胞可作为CIAV潜在感染靶细胞,将pcDNA3.1-Hygromycin-VP1重组质粒转染LMH,通过药物潮霉素B筛选及有限稀释克隆法,初步获得表达CIAV的VP1的LMH细胞系。CIAV的VP1基因真核表达载体获得及其表达细胞系的初步构建为鉴定VP1介导CIAV感染分子基础及其细胞受体打下了基础。3.抗鸡传染性贫血病毒VP1单克隆抗体的研制为研制抗CIAV的VP1单克隆抗体,本研究在分析VP1的亲水性及抗原性基础上,以设计合成的两段多肽Peptides-1和Peptides-2为免疫原免疫Balb/c小鼠,以合成多肽和转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1真核表达质粒的293T细胞作为筛选原。通过常规方法将小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合、ELISA与IFA筛选鉴定及亚克隆,最终获得5株分泌抗CIAV的VP1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。其中一株是针对表位多肽Peptides-1,命名为CIAV-VP1-1C5;其余4株针对表位多肽 Peptides-2,分别命名为 CIAV-VP1-2E3、CIAV-VP1-2B3、CIAV-VP1-3F4及CIAV-VP1-3C10。5株抗VP1单克隆抗体不仅与包被表位多肽Peptides-1或Peptides-2具有良好的ELISA反应性,而且能通过IFA识别在LMH细胞中表达的VP1蛋白。抗VP1单克隆抗体的研制不仅为进一步构建基于VP1蛋白的CIAV的诊断技术开发提供了试剂,而且为鉴定VP1介导的CIAV感染细胞受体打下了基础。