论文部分内容阅读
[背景和目的] HBV感染肝细胞后，病毒抗原被抗原提呈细胞(APC)的蛋白酶体裂解成小分子的寡肽，并与肝细胞内HLA—Ⅰ类分子结合成复合物，表达于细胞表面，成为T细胞表位。CTL通过表面的CD8~+分子与HLA—Ⅰ类分子产生粘附，并由TCR识别上述寡肽表位，此类CTL即为HBV抗原特异性CTL(HBV antigens specific cytotoxic lymphocytes，HBV sCTL)。近期一系列的研究显示，乙肝病毒抗原特异性细胞毒T淋巴细胞应答在乙肝感染中有重要意义。HBV特异性CTL通过分泌大量IFN-γ等发挥非损伤清除HBV作用，这种作用发生在肝细胞损伤前，后续引起的肝细胞损伤可能与特异性应答后引起非特异性免疫活性细胞在肝内浸润、凋亡激活等有关。进一步研究揭示，HBV特异性应答功能的差异与乙肝患者的不同临床转归密切相关。在自限性急性乙型肝炎患者中，特异性CTL应答作用强，可能与病毒被迅速清除而肝细胞损伤轻有关，而在慢性乙型肝炎患者中，特异性CTL应答能力弱，可能与清除病毒能力不足而导致炎症细胞浸润和慢性化有关。新近研究认识到，通过刺激特异性CTL应答可能是促进慢乙肝患者病毒清除和机体恢复的一种有效途径。本课题受上述研究启发，采用以主要组织相容性复合物—抗原肽四聚体(HLA—肽四聚体，Tetramer)流式细胞技术为核心的HBV特异性CTL实验研究新技术，围绕具有典型的清除病毒和肝细胞损伤双重作用的乙型重型肝炎患者为主要研究对象，对乙肝病毒感染的特浙江大学博士学位论文异性CTL应答机制作初步探讨，旨在为乙肝的发病机理研究、有效防治等提供新的思路和新的实验研究技术平台。l材料和方法】1.研究对象自2002年2月一2003年8月间收治的慢性乙肝患者共34例，经组织分型技术获得HLA一A2‘19例，包括男n例，女8例，年龄16一54岁，平均年龄32岁;余15例HLA一A2一作为对照组，包括男10例，女5例，年龄28~49岁，平均年龄34岁。血清HBsAg阳性的病毒携带者25例，其中HLA一A2’14例，包括男7例，女7例，平均年龄36岁;余n例HLA一A2一作为对照组，包括男5例，女6例，平均年龄34岁;急性乙型肝炎患者共10例，其中HLA一A2’6例，包括男5例，女1例，年龄30一56岁，平均年龄42岁，余4例HLA一A2一作为对照组，包括男3例，女1例，年龄26一42岁，平均年龄35岁。经组织分型为HLA一A2+的乙型重型肝炎患者共42例，分成两组:一组为急性乙型重型肝炎，共20例，其中男12例，女8例，年龄18一46岁，平均年龄30岁;另一组为慢性乙型重型肝炎，共22例，其中男巧例，女5例，年龄33一65岁，平均年龄45岁。全部符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎诊断标准。HLA一A2+的健康人15例，检测血清甲、乙、丙、丁、戊肝炎病毒标志物以及HIV抗体等均阴性，作为正常对照组。2.实验方法 (l)外周血单个核细胞(PBMO分离:空腹静脉采集全血标本，采用淋巴细胞分离液分离PB珑。 (2) HLA分型技术:采用流式细胞技术快速检测HLA一A2抗原分型，并用序列特异引物聚合酶链反应(Sequenee sp舰ine Primer Polymera:e Chain Reac幼on，SSP-PCR)分型技术确认。 (3) Tetramer流式细胞技术测定PB就中特异性CDS℃TL数量:采用藻红蛋白 (PE)标记的HLA一肤四聚体(Tetramer)和荧光色素(FITC)标记的anti一DS+，通过双色标记流式细胞技术检测分别针对HBv corels一27、polym~575一583和envelo伴335一 343表位的特异性的CDS‘T细胞，并以针对HCvC区178一187表位乙肝病毒感染的特异性CTL应答机制研究陈瑜2001年秋2浙江大学博士学位论文的Tetralner作为对照。计数50 000个CDS‘阳性细胞，同时计数CDS+和Tetralner双阳性细胞为特异性CDS+细胞，并以占总计数CDS’细胞的百分比表示。(4)EI ispot技术测定特异性CTL表达INF一Y、TNF一a、IL一4和IL一10水平:按照试剂盒说明，先将针对上述细胞因子的特异抗体包被于专用酶标板中，再加入经HBV eorels一27肤段刺激、RPMll640培养36h的PB毗，孵育后加入第二抗体，经底物显色反应，用解剖显微镜观察计数整个视野紫色斑点数量，代表表达水平。(5)特异性eTL裂解靶细胞能力测定:采用CytoTox96 Non一RadioaetiveCytotoxieity Assay试剂盒，将经HBv eore18一27短肤、重组乙肝病毒核心抗原(rHBcAg)共刺激培养13日的PBMC与HLA一A2+的靶细胞(B一LCL)按一定比例混合，靶细胞被裂解后，释放的乳酸脱氢酶与底物反应显色，酶标仪测定吸光度，吸光度与裂解程度成正比，按照公式计算百分裂解率(%)。 (6)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定:使用HITACHI 7600一110型全自动生化分析仪测定。 (7)血清pZ微球蛋白(p 2 mierog一obu一in，pz一Me)测定:采用AxsYM全自动免疫分析系统的微粒子酶免疫分析技术(microparticlee拓理meimmunoassay，MEIA)测定。 (8)血清细胞因子INF一Y、TNF一a、IL一4和IL一10测定:采用定量ELISA技术测定。(9)血清HbcAg测定:采用AssYM全自动免疫分析系统的微粒子酶免疫分析技术(ME认)定量测定。 (10)数据的统计学处理:?