沙门菌病是由沙门菌感染引起的人与动物共患的传染病,对养殖业造成严重的危害。由于人群感染率的不断上升也使得沙门菌病成为影响全球的公共卫生问题。抗菌肽是由动植物产生一类具有广谱抗菌活性的多肽或蛋白质。本试验通过转录组测序技术分析鼠伤寒沙门菌在多粘菌素B刺激后的基因表达差异,对差异基因进行功能注释及聚类分析,根据基因功能选择目标基因,利用Red重组技术,以鼠伤寒沙门菌为亲本菌株,构建相关基因缺失株及其互补菌株,对其生长特性、多粘菌素B耐受性、抗氧化能力、抗酸能力、细胞感染以及体内毒力等生物学特性进行测定。RNA-seq分析结果显示,鼠伤寒沙门菌经多粘菌素B刺激后,共出现525个显著差异基因,其中上调基因有297个,下调基因有228个。GO功能聚类表明,在多粘菌素B刺激下沙门菌差异基因主要集中在非膜结合细胞器、核糖体蛋白复合物、大分子蛋白质定位、蛋白质转运、结构分子活性等功能,表明多粘菌素B与沙门菌主要作用部位在细胞膜,且相关基因参与细胞内蛋白质的合成和转运;KEGG途径分析结果显示,鞭毛组装、阳离子抗菌肽抗性、乙醛酸和二羧酸代谢、铁载体非核糖体肽的生物合成等途径显著富集,可以看出多粘菌素B主要作用途径在细胞运动、免疫调节以及小分子合成。根据测序结果及文献报道,挑选了 19个目标基因,进行了后续研究。Red重组技术被广泛用于沙门菌基因缺失株的构建。根据NCBI公布的Salmonella Typhimurium ATCC 14028s全基因组序列,确定目标基因序列。对基因缺失条件进行摸索,摸索条件为:(1)打靶片段浓度为500-800ng;(2)制作电转感受态细胞时,L-阿拉伯糖浓度为30 mmol/mL,OD600值0.6-0.8左右;(3)在对线性打靶片段进行电转时电压为2 kv;(4)氯霉素基因消除时菌株在42℃摇床复苏2h。最终成功构建获得以下基因缺失株:SMΔsapB、SMΔsapC、SMΔyejE、SMΔyejF、SMΔompC、SMΔomp W、SMΔSTM1485、SMΔSTM2759、SMΔyjeA、SMΔsufC、SMΔsufD、SMΔmarA、SMΔmgtC、SMΔpmrD、SMΔydhC、SMΔmgtC、SMΔscsA、SMΔtetR、SMΔexbB,并成功构建其互补菌株。对上述构建的19个基因缺失株进行生物学功能研究结果表明,与亲本菌株相比,所有基因的缺失不影响沙门菌生长:SMΔyejE、SMΔompW、SMΔmarA、SMΔpmrD对多粘菌素B的抵抗作用显著减弱;SMΔsapC和SMΔmarA对酸性环境耐受降低。由此证明yejE、ompW、marA、pmrD基因与多粘菌素B抵抗作用相关,sapC和marA基因与沙门菌酸性耐受相关,marA基因同时与酸性耐受和抗菌肽抵抗作用相关。SMΔyjeA、SMΔsapB、SMΔsapC、SMΔmgtC细胞内生存能力降低,注射SMΔyjeA和SMΔsapB的小鼠肝、脾载菌量降低,体内生存时间缩短,表明yjeA、sapB基因的缺失影响了沙门菌体内外的毒力。综上,本研究对多粘菌素B刺激下的沙门菌进行了转录组学分析并挑选目标基因,利用Red重组系统构建基因缺失株,在体外和体内对基因缺失株的生物学特性进行了测定,初步筛选获得与沙门菌抗菌肽和酸性耐受相关基因以及毒力相关基因,为进一步阐述沙门菌致病机制和基因工程疫苗的研发提供了数据支持。