研究背景糖尿病（Diabetic mellitus,DM）是一种严重威胁人类健康的营养相关疾病。随着膳食模式和生活方式的改变,DM患病率逐年升高,其中2型糖尿病（Type 2 DM,T2DM）占90%,已成为国家亟待解决的重大公共卫生问题。各种血管并发症是DM主要的致死、致残原因。其中,糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是DM严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏病的主要原因,致死、致残率极高,对患者生命健康形成严重威胁,给社会经济造成巨大负担。迄今,尚缺乏可有效阻止DN发生发展的干预手段。因此,探索DN的有效营养学干预手段对DN的预防具有重要的科学意义和社会价值。南极磷虾油（Krill oil,KO）是从南极磷虾中提炼的功能性食物,富含ω-3多不饱和脂肪酸、虾青素和磷脂等功效成分。研究显示,KO具有抗炎、抗氧化等功效,其对DN的干预作用尚未见报道。本研究拟评价KO对小鼠DN的干预作用,并进一步探讨其作用机理。研究目的1.评价KO对小鼠DN的干预作用。2.探讨KO对小鼠DN的作用机理。研究方法1.评价KO对小鼠DN的干预作用采用链脲佐菌素腹腔注射联合高脂饲料喂饲的方法建立小鼠T2DM模型。选取7周龄雄性C57BL/6N小鼠,适应性喂养一周后,造模小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素（50 mg/kg）,非糖尿病对照组（control,Ctrl组）连续5天腹腔注射溶剂柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L）。一周后检测血糖,血糖值≥ 13.89 mmol/L提示DM成模。成模小鼠随机分为糖尿病模型组（DM组）和糖尿病KO干预组（DM+KO组）。Ctrl组、DM组、DM+KO组分别给予正常饲料、高脂饲料、含1.5%KO的高脂饲料喂饲。实验期间每两天更换一次食物,记录进食量和体重;每4周监测血糖、留取尿液;DM成模22周时,进行葡萄糖耐量试验;DM成模24周后,留取小鼠肾脏进行指标检测。1.1使用试剂盒检测各组小鼠尿液中微量白蛋白和肌酐的含量,计算二者的比值;1.2应用苏木素-伊红染色、过碘酸雪夫氏染色和马松染色评价小鼠肾脏的病理变化;1.3通过荧光定量PCR检测肾脏炎症、氧化应激和纤维化等基因mRNA的表达水平;1.4通过蛋白质免疫印迹法检测肾脏炎症、氧化应激和纤维化等基因蛋白质表达水平;1.5采用免疫组化法对肾脏特定蛋白质进行定位。2.探讨KO对DN的作用机理采用高糖（High glucose,HG,30 mmol/L）刺激小鼠肾小球系膜细胞（Mouse mesangial cells,MMCs）的方法建立MMCs损伤模型。HG刺激的同时分别给予KO或甘油（KO的溶剂）干预。细胞实验分为正常糖对照组（5.5 mmol/L）、正常糖+甘露醇组、HG刺激组、HG刺激+甘油组、HG刺激+KO干预组。HG刺激48小时后收集各组细胞进行指标检测。2.1提取mRNA,进行RNA测序分析,筛选KO主要作用分子通路和靶点。2.2采用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹法对所筛选出的关键分子通路进行mRNA和蛋白质水平验证。2.3依据RNA测序和验证结果,采用转化生长因子-beta 1（transforming growth factor-beta 1,TGF-β1,10 ng/mL）处理MMCs,分别同时给予KO或甘油干预,检测纤维化基因的表达水平。2.4采用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹法检测TGF-β1信号通路关键因子TGF-β1 受体 1、TGF-β1 受体 2、SMAD4、SMAD7、SMAD2、SMAD3、p-SMAD2 和 p-SMAD3的表达水平。采用免疫荧光法检测SMAD2/3由细胞质向细胞核转移的情况。2.5通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学染色进一步在小鼠肾脏中验证细胞实验中筛选、鉴定出的TGF-β1信号通路关键分子的表达水平,观察KO对DM小鼠肾脏中上述因子表达的影响。研究结果1.动物实验发现,KO虽未改善DM小鼠血糖和葡萄糖耐量,但可显著降低DM小鼠尿微量白蛋白与尿肌酐比值,预防DM所致肾小球系膜基质增多、肾小球肥大和肾小球纤维化等病理损伤。KO还可有效抑制DM小鼠肾脏炎症、氧化应激和纤维化基因表达。2.细胞RNA测序发现,KO可显著调控TGF-β1信号通路基因表达。进一步实验验证发现,KO可显著抑制TGF-β1诱导的纤维化基因表达。进一步机制探讨发现,KO可抑制TGF-β1诱导的SMAD2/3磷酸化和向细胞核移位,并可上调SMAD2/3磷酸化过程的负调控基因Smad7表达。3.在DM小鼠肾脏中,KO可抑制SMAD2/3磷酸化,并可上调Smad7基因表达水平。研究结论1.KO可有效预防DM小鼠肾功能障碍和肾脏病理损伤,抑制炎症、氧化应激和纤维化基因表达,对小鼠DN有较好的预防作用。2.KO可能主要通过上调TGF-β1信号通路中的Smad7基因表达、抑制SMAD2/3活化入核来抑制DM小鼠肾脏纤维化。