研究目的研究生物标志物E-cad、β-cat、P27、CyclinD1、MT、Ki-67及EGFR在滑膜肉瘤组织中的表达与肿瘤生物学特点，并探讨上述标志物与患者术后生存时间的关系。寻找新的与滑膜肉瘤预后相关的分子标记物，以期为临床提供更多的信息，指导治疗，减少复发与转移。研究方法本实验为回顾性研究：复习解放军总医院病理科1993年5月-2006年5月间手术切除、福尔马林固定、常规石蜡包埋的滑膜肉瘤组织标本共88例，2例来自尸检，总计90例。经导师复读HE染色切片，结合细胞角蛋白(Cytokeratin)、上皮膜抗原(EMA)、波形蛋白(Vimentin)、Bcl-2及CD99等免疫组化染色结果确定并排除可疑标本，得到83例。随后按照Bergh等人的标准分类，查阅相关病历，并对其进行随访。最终得到完整的临床资料、病理资料及随访资料60例(其中包括2例尸检)。免疫组化染色：采用PV6000二步法，检测60例滑膜肉瘤中E-钙粘素(E-cad)、β-连接素(β-cat)、P27、CyclinD1、金属硫蛋白(MT)、Ki-67和EGFR阳性表达率及β-cat的异常表达率，分析其与临床病理资料及预后的关系。EGFR基因突变的检测：提取20例滑膜肉瘤石蜡标本的DNA，进行定量测定，并采用聚合酶链反应技术进行扩增反应，用扩增产物来进行纯化及测序分析，观察其EGFR基因第18、19、20及21外显子的突变情况。结果1．滑膜肉瘤相关生物标志物的表达及其与临床病理资料及生存率的关系1)各生物标志物在滑膜肉瘤中表达的阳性率分别为E-cad 28．3％(17／60)，β-cat 23．3％(14／60)，β-cat异常表达45％(27／60)，P27 45％(27／60)，CyclinD140％(24／60)，MT 56．6％(34／60)，Ki-67 46．6％(28／60)，EGFR 28．3％(17／60)。2)与分型有关的是E-cad、β-cat及β-cat异常表达。E-cad及β-cat的阳性表达与病理学分型呈负相关，而β-cat异常表达与其呈正相关。其中在双相型滑膜肉瘤中E-cad和β-cat的阳性表达率均明显高于单相型及低分化型滑膜肉瘤(P均<0．05)，β-cat的异常表达在双相型滑膜肉瘤中的阳性率明显低于单相型及低分化型滑膜肉瘤(P=0．001)。此外，β-cat非异常表达阳性率自组织学分级Ⅱ级至Ⅲ级为逐级减弱(P=0．025)，而β-cat的异常表达在Ⅱ级至Ⅲ级中有逐渐增强的趋势，但无统计学意义。β-cat的异常表达还与患者肿瘤部位、TNM分期及转移有关，与患者肿瘤部位、TNM分期及转移均呈正相关(P均<0．05)；β-cat的异常表达在四肢的阳性率明显高于躯干(P=0．004)，TNM分期越高β-cat的异常表达率越高(P=0．007)，β-cat异常表达在转移组的阳性率明显高于未转移组(P=0．000)，而E-cad和β-cat在未转移组的阳性率有高于转移组的趋势，但无统计学意义。P27与肿瘤转移呈负相关，而CyclinD1与转移呈正相关；P27未转移组的阳性率高于转移组(P=0．025)，而CyclinD1则转移组的阳性率高于未转移组(P=0．033)。此外，P27阳性表达与肿瘤组织学分级呈负相关；P27在组织学Ⅱ级的阳性率明显高于Ⅲ级(P=0．044)。MT与Ki-67阳性表达均与转移呈正相关，两者转移组的阳性率明显高于未转移组的阳性率(P均<0．05)。此外，Ki-67与肿瘤直径呈正相关，肿瘤直径<5cm的阳性率低于直径≥5cm的阳性率(P=0．047)。MT还与组织学分级和TNM分期呈正相关；组织学分级和TNM分期高者MT阳性率高(P均<0．05)。EGFR的阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、部位、分型、TNM分期、组织学分级、及转移情况等均无关(P均>0．05)。3)单因素生存分析显示，TNM分期、组织学分级、转移、MT、P27、E-cad、β-cat异常表达及Ki-67等8种因素与滑膜肉瘤患者的术后生存时间具有统计学差异：TNM分期及组织学分级级别越高的患者术后生存时间越短(分别为P=0．000、P=0．048)；未转移组患者较转移组患者的术后生存时间长(P=0．000)。MT与Ki-67阳性表达组患者的术后生存时间均短于阴性表达组(分别为P=0．010、P=0．027)；P27阳性表达组患者较阴性表达组患者的术后生存时间长(P=0．008)；滑膜肉瘤中E-cad阳性表达组患者较阴性表达组患者的术后生存时间长(P=0．042)；β-cat异常表达的阴性表达组患者较阳性表达组患者的术后生存时间长(P=0．002)，同时β-cat非异常表达组患者较异常表达组患者的术后生存时间长(P=0．007)。随后Cox多因素生存分析显示，3种入选模型，分别是MT、P27及转移。MT阴性表达、P27阳性表达及未发生转移者术后生存时间长，预后较好。2．滑膜肉瘤中EGFR基因突变的检测在20例滑膜肉瘤EGFR基因突变的检测中，2例免疫组织化学染色结果显示EGFR表达为阳性的病例经过了测序分析，突变率为10％。结果显示：1例EGFR基因第20号外显子发生了一处错义突变，突变位点位于第796号密码子2386位碱基处(GGC→AGC)，氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸(Gly→Ser)；另1例EGFR基因第19号外显子发生了一处错义突变，突变位点位于第731号密码子2191位碱基处(TGG→CGG)，氨基酸由色氨酸变为精氨酸(Trp→Arg)。此外，还有2例患者(经免疫组织化学染色显示：1例EGFR染色呈阳性表达，1例呈阴性表达)检测出EGFR基因发生了同义突变，突变率为10％。1例为第20号外显子第787号密码子2361位碱基处(Gln：CAG→CAA)；1例为第18号外显子第725号密码子2175位碱基处(Thr：ACG→ACA)。提示EGFR基因酪氨酸激酶区域在滑膜肉瘤中的突变相当罕见，且可能仅有少数患者有机会从EGFR受体酪氨酸激酶的靶向治疗中受益。因此，对于EGFR基因表达的突变与指导临床用药治疗还需大量样本进一步探讨及证实。结论1．MT、P27及转移是滑膜肉瘤的独立预后因子。2．E-cad、β-cat、P27、CyclinD1、MT及Ki-67均与滑膜肉瘤的发生发展和(或)转移密切相关，细胞黏附因子E-cad表达下调及β-cat的异常表达可能导致肿瘤细胞间的黏附力减弱、运动能力加强；细胞周期素依赖性激酶抑制剂P27限制性的调节了细胞周期进程等。上述生物标志物表达的变化可能对滑膜肉瘤的演化和进展起重要作用，并可能成为新的临床辅助诊断和监测预后的指标。3．在滑膜肉瘤中，EGFR基因第18-21号外显子发生突变相当罕见，需要大量样本进一步探讨及证实。