食管鳞癌是常见的消化道恶性肿瘤,其死亡率高,预后较差。食管鳞癌发生发展过程为在炎症因子等环境因素的刺激下,其基因组逐渐发生改变,表型体现为从增生到乳头状瘤,再到鳞癌,其中涉及到增殖-分化稳态逐渐失衡这一过程。但从食管上皮增生转变为食管鳞癌这一过程,其增殖-分化稳态发生紊乱的机制仍不清楚。食管鳞癌病人多为晚期患者,因此难以了解导致食管鳞癌早期阶段增殖-分化稳态失衡的驱动基因。目前的大鼠食管鳞癌模型建模时间长,肿瘤突变负荷较高,难以区分导致食管上皮增殖-分化稳态的驱动基因。因此我们需要基因组背景清楚,建模时间短,稳定性良好,可重复性强,操作简单,并且与体内食管组织结构相似的体外模型来研究食管上皮增殖-分化稳态的失衡过程。类器官是目前研究发育和癌变过程的一个较好的体外模型,是干细胞或器官特异性祖细胞在特殊的培养条件下,自我组织为与体内器官结构功能相似的三维立体结构,本实验已经成功建立大鼠食管类器官模型,并基于此模型探究影响食管上皮增殖-分化稳态的关键基因,并为理解食管鳞癌的病变过程提供重要的理论基础。首先,我们对大鼠食管类器官生长模式进行了详细的研究,发现大鼠食管类器官遵循不对称生长模式,由于类器官在2-5天的结构都是不对称的细胞团块结构,到第6天时才出现复层鳞状结构,因此,我们将大鼠食管类器官生长模式分成两阶段,分别为食管起始发育阶段和增殖-分化稳态阶段。接下来,我们通过免疫荧光手段检测了类器官两阶段中Sox2和p63的定位和表达情况,发现在第4天时出现了 p63-Sox2+细胞亚群,且这群细胞也一直维持到第10天食管类器官成熟时。此外,我们通过单细胞测序技术进一步明确食管类器官中确实存在这群细胞。接着,我们通过建立过表达Sox2类器官模型和两阶段敲降Sox2类器官模型,明确Sox2在食管起始发育和增殖-分化稳态过程中具有重要作用。为了明确食管类器官中p63-Sox2+细胞亚群的功能,我们建立了食管类器官炎症损伤模型,发现这群细胞在炎症损伤食管类器官中过度增殖,且这种增殖现象是可逆的。接下来通过shRNA分别敲降食管类器官稳态阶段中的Sox2和p63,进一步证实是p63-Sox2+细胞亚群参与了炎症损伤应答过程,当p63-Sox2+细胞亚群的缺失会导致食管类器官增殖-分化稳态失衡,失去对炎症损伤的应答反应。过表达Sox2后,p63-Sox2+细胞亚群对炎症损伤的应答反应增强。最后,我们通过建立的人食管鳞癌细胞系类器官和大鼠食管鳞癌类器官模型研究Sox2和p63在鳞癌中的定位和表达情况,发现Sox2和p63在鳞癌中往往是共同高表达,且不存在p63-Sox2+细胞亚群。综上所述,本研究通过成功建立的大鼠食管类器官模型明确了食管的生长模式,包括发育和增殖分化稳态两个阶段,通过免疫荧光手段和单细胞测序技术发现了 p63-Sox2+细胞亚群,接着建立了炎症损伤模型,证明了 p63-Sox2+细胞亚群在食管损伤再生修复过程中具有重要的作用,且这群细胞在修复损伤过程中的过度增殖现象是可逆的。本研究结果为食管干细胞标志物以及食管癌病因学等食管相关研究提供了理论基础。