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目的:本课题研究基于野生型人乳腺癌细胞株(MCF-7)及耐阿霉素(ADR)人乳腺癌细胞株(MCF-7/ADR)的Small RNA二代测序结果,同时,结合国内外相关文献筛选出在MCF-7/ADR细胞中差异表达的Hsa-miR-1284(miR-1284)、Hsa-miR-1247-5p(miR-1247-5p)作为研究对象。合成miR-1284、miR-1247-5p模拟物(mimics)转染至MCF-7/ADR,研究miR-1284、miR-1247-5p是否能逆转MCF-7/ADR耐药性以及对MCF-7/ADR细胞功能产生影响。另外,对miR-1284、miR-1247-5p逆转MCF-7/ADR耐药性分子机制进行研究。本研究旨在为miRNA治疗耐药性乳腺癌提供理论基础和参考依据。方法:1.MCF-7/ADR耐药性的检测采用MTT法比较MCF-7、MCF-7/ADR细胞耐药差异。2.验证miR-1284、miR-1247-5p在MCF-7/ADR细胞中表达水平利用qPCR实验方法检测MCF-7、MCF-7/ADR中miR-1284、miR-1247-5p表达情况,验证是否与二代测序结果显示一致。3.miR-1284、miR-1247-5p生物信息学分析利用RNAhybrid、Miranda、TargetScan在线工具预测miR-1284、miR-1247-5p靶基因,取3种预测结果的交集作为最终预测结果。以人类基因组为背景,利用GO ontology(GO)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对两小分子的靶基因的生物学过程和富集的信号通路进行富集分析。4.miR-1284、miR-1247-5p对MCF-7/ADR增殖及细胞功能的影响采用WST-1法、流式细胞术以及transwell小室检测方法检测miR-1284、miR-1247-5p对MCF-7/ADR细胞的增殖及细胞功能的影响。5.cBioPortal网站分析基因突变率、基因间相关性、对乳腺癌患者总生存率的影响利用cBioPortal网站分析TGF-b信号通路中8个关键基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、ZEB1、SNAI1、SNAI2、CDH2、VIM的突发率、基因间相关性、以及对乳腺癌患者总生存率的影响。6.miR-1284、miR-1247-5p对MCF-7/ADR细胞中的SMAD2等8个基因表达情况的影响采用qPCR实验方法检测转染miR-1284、miR-1247-5p后MCF-7/ADR中SMAD2、SMAD3、SMAD4、ZEB1、SNAI1、SNAI2、CDH2、VIM表达情况。结果:1.MTT法结果表明MCF-7/ADR细胞对ADR耐药性显著高于野生MCF-7细胞。2.采用qPCR实验方法验证MCF-7、MCF-7/ADR中miR-1284、miR-1247-5p表达情况。qPCR实验结果与二代测序结果显示一致,miR-1284、miR-1247-5p在MCF-7/ADR细胞中低表达。3.在线工具预测miR-1284、miR-1247-5p靶基因个数分别为1918和581个。miR-1284靶基因GO生物学过程主要集中生物过程调节、细胞分化、细胞死亡的调节和细胞周期等。miR-1247-5p的靶基因则主要集中生物过程负调节、细胞分化、细胞增殖调节、SMAD蛋白复合物装配等。miR-1284靶基因富集通路主要有肿瘤转录失调通路及MAPK、TGF-b信号转导等通路,而miR-1247-5p靶基因主要富集在肿瘤转录失调通路及ABC转运体通路等。4.转染48 h后,miR-1284、miR-1247-5p显著抑制了MCF-7/ADR细胞增殖,提高MCF-7/ADR对ADR的敏感性;miR-1284、miR-1247-5p显著增加MCF-7/ADR细胞的凋亡率;与NC组相比,显著降低了MCF-7/ADR细胞的S期分布率,明显提高了G0/G1期的分布率;减少transwell小室侵袭和迁移实验中细胞穿膜数。5.cBioPortal网站结果显示miR-1284、miR-1247-5p靶基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SNAI2与EMT过程中的关键基因ZEB1、SNAI1、CDH2、VIM存在正相关关系,同时,SMAD2、SMAD3、SMAD4、ZEB1、SNAI1、SNAI2、CDH2、VIM均在乳腺癌患者中有较高的突变率。另外,分析表明抑制这8个基因突变有利于乳腺癌患者的生存。6.miR-1284降低了MCF-7/ADR细胞中SMAD3,ZEB1、VIM表达水平,而miR-1247-5p下调了SMAD2、SMAD3、SMAD4、ZEB1、SNAI1、CDH2、VIM表达水平。结论:1.MCF-7/ADR具有较高耐药性。2.miR-1284、miR-1247-5p在MCF-7/ADR细胞中低表达。3.通过对靶基因生物信息学进行分析,发现miR-1284、miR-1247-5p可能在MCF-7/ADR肿瘤细胞的生长和耐药中发挥着重要影响。4.miR-1284、miR-1247-5p抑制MCF-7/ADR细胞增殖,提高MCF-7/ADR对ADR的敏感性;促进MCF-7/ADR细胞凋亡;使MCF-7/ADR细胞周期阻滞G0/G1期,同时也影响细胞DNA合成;减少MCF-7/ADR细胞的侵袭和迁移。5.cBioPortal网站分析结果表明miR-1284、miR-1247-5p调控TGF-b/SMADs信号通路中靶基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SNAI2可能会进一步影响下游基因ZEB1、SNAI1、CDH2、VIM的表达,影响EMT过程,从而来参与耐药。6.初步表明miR-1284、miR-1247-5p通过调控TGF-b/SMADs信号通路来参与乳腺癌耐ADR过程。