草莓ARF基因家族的生物信息学分析及MIR167与靶基因ARF6的功能鉴定

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生长素参与调控植物生长发育的许多阶段,是十分重要的植物激素。同时,ARF家族对生长素信号进行调控,是一类重要的转录因子。迄今为止,拟南芥、葡萄、番木瓜、苹果等许多物种ARF家族生物信息学的研究相继被报道,但关于草莓ARF家族鲜有报道。本研究对草莓ARF基因家族进行生物信息学鉴定并构建了MIR167及ARF6过表达载体,ARF6干扰载体,获得了转基因草莓植株,通过转基因植株的表型观察揭示出草莓MIR167、ARF6基因的功能。主要结果如下:(1)从NCBI数据库中获得12个草莓ARF家族基因(FvARFs),分别是FvARF1、FvARF2、FvARF3、FvARF4、FvARF5、FvARF6、FvARF8、FvARF9、FvARF17、FvARF18、FvARF19和FvARF23。对家族基因进行系统进化分析,12个基因在进化树中被分为四个分支,FvARF6与AtARF6、FvARF3与MdARF3、FvARF23与MdARF23、FvARF1与MdARF1等为同一分支的姐妹基因对,进化关系较近。FvARFs不平均的分布在五条染色体上,FvARFs都含有三个保守的结构域,只有FvARF3、FvARF17、FvARF18是截断的CTD结构域。家族基因外显子、内含子结构不同,内含子的数量从1-16不等。利用MEME数据库分析显示,除FvARF17之外,家族基因保守基序分布及结构相似。(2)以‘艳丽’草莓为试材,采用qRT-PCR的方法对其不同器官、不同发育时期的果实进行基因表达量分析发现:FvARFs在所有器官中均有表达;在不同的果实发育阶段FvARFs的相对表达量均是随着果实的成熟表达量逐渐降低。(3)对‘Ruegen’草莓试管苗采用10μmol·L-1的IAA分别处理0 h,6 h,12 h,24 h,48 h和不同IAA浓度(0μmol·L-1,0.1μmol·L-1,1μmol·L-1,10μmol·L-1,25μmol·L-1)处理12 h。qRT-PCR结果显示,10μmol·L-1IAA处理12 h时ARF家族基因表达量最高。(4)利用RT-PCR的方法从‘艳丽’草莓中克隆出MIR167及靶基因ARF6,获得ARF6基因的编码区全长2646 bp,编码882个氨基酸,与NCBI数据库中二倍体ARF6序列相似度高达98.68%,克隆出的MIR167基因长度为305 bp。(5)构建了ARF6突变基因的过表达载体、MIR167基因过表达载体、ARF6干扰载体,采用农杆菌介导的遗传转化将其转入‘Ruegen’草莓苗中。得到MIR167过表达植株4个株系和ARF6干扰植株3个株系。表型观察发现MIR167过表达植株和ARF6干扰植株都表现出分枝数和根系数量的增加,ARF6干扰植株叶片深绿狭长并呈现出向内卷曲皱缩的现象。(6)构建了pGBKT7-ARF6融合载体并与pGBKT7空载体同时转化酵母菌感受态,通过一缺、三缺培养基的长势分析,鉴定出ARF6为转录激活因子。
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