致病弧菌宽谱噬菌体的分离鉴定、生物特性和应用研究

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致病弧菌是可引起人和水生生物共患病的一类病原性弧菌。弧菌的防治一般采用抗生素或化学制剂等,但随着耐药性菌株的出现,防控变得十分棘手,由此,噬菌体的应用重新出现在大众视野。本研究意在筛选对多种致病性弧菌具有高效裂解性的宽谱噬菌体,并应用此类噬菌体制备成新型生物抑菌剂,来控制水产品养殖和加工过程中致病性弧菌的繁殖和污染。(1)从海鱼、淡水鱼、贝类宰杀污血水样品中分离纯化得到27株弧菌噬菌体,6株弧菌噬菌体透射电镜下形态分别为短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科两类。经裂解谱测定,得噬菌体VppYZU-Y1和噬菌体OY-1裂解谱最宽,在pH5.0~12.0条件下噬菌体的稳定性较好,属于耐碱不耐酸型;50℃~80℃条件下噬菌体活性逐步降低。对噬菌体进行最佳感染复数、一步生长曲线的测定,挑选得到出稳定性好,裂解能力强的噬菌体。(2)采用全基因组测序的方法测定噬菌体的基因信息。噬菌体OY-1的全基因组信息未找到同源噬菌体,判断该噬菌体为新噬菌体。噬菌体OY-1的基因组全长为43479 bp,其中编码基因总长度分别为38403 bp,平均长度分别为936.66 bp,占总长的88.33%,GC含量为49.26%,有41个开放阅读框(ORFs)。己知编码基因中有DNA聚合酶等调控核酸代谢和表达的基因、主要衣壳蛋白等结构蛋白基因、蛋白酶裂解相关的基因等。未发现抗生素耐药基因以及毒力基因,为后续应用实验安全性提供理论依据。。(3)涂布测定弧菌正常生长与经噬菌体处理后的生长曲线,对比得出噬菌体对弧菌的跨种抑制效果。总菌落数均随着时间的延长而增加,噬菌体组总菌落数在培养过程中始终低于对照组,2株噬菌体对三种不同弧菌及混合菌都表现有明显抑制作用,尤其是噬菌体VppYZU-Y1对拟态弧菌CICC 21613前12 h抑制几乎达到0 CFU/mL,于8~12 h与对照组出现最大差值,噬菌体VppYZU-Y1效果普遍优于噬菌体OY-1。(4)结晶紫96孔板法测定噬菌体对弧菌的抗生物膜能力。结果经SPASS分析表明MOI在0.1及以上都有极显著效果,噬菌体VppYZU-Y1对副溶血性弧菌CICC 21617生物膜处理后OD600nm值下降90%左右;25℃和37℃温度下两株噬菌体及噬菌体混合液对三种单菌和混合弧菌均表现出极显著效果。表明在这两株噬菌体的干扰下,弧菌难以形成生物膜,以及形成生物膜后能被噬菌体有效去除。(5)弧菌污染在水产品加工中对产品品质及安全影响大,尤其鲭鱼科易受弧菌影响产生生物胺等安全问题,因此应用噬菌体联合乳酸菌发酵鲭鱼改善鱼肉品质。检测发酵鱼肉的微生物指标、TVBN、TBARS、pH、生物胺等,初步发现乳酸菌能提高发酵鱼品质,但在鱼块被弧菌污染的情况下,由于发酵初期由于乳酸菌生长代谢慢但弧菌生长速度快因此不能及时控制产品质量,应用分离的噬菌体联合乳酸菌共同作用于弧菌污染的鲭鱼,结果表明噬菌体在发酵鱼体系中对弧菌有明显抑制效果,且添加有噬菌体的实验组pH值一直低于对照组;TVBN值和TBARS值结果显示乳酸菌噬菌体联合组比其它组能更长时间的保持在限值以内。利用噬菌体前期高效裂解弧菌的特性联合乳酸菌能有效改善发酵鱼品质。
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