阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是以进行性认知功能下降为临床特征神经退行性疾病,是导致老年人痴呆最常见的原因,然而目前尚没有令人满意的治疗措施。目前我国AD患者的数量随着老龄化的加剧在迅速增长,给社会和家庭带来沉重的负担,因此对AD的研究具有重要的意义。老年斑(senile plaque, SP)、神经元纤维缠结以及选择性神经细胞凋亡是AD特征性的病理改变,而SP形成与p-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)的沉积有关。研究证实Ap具有神经毒性,可使细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增加,使胞膜脂质和蛋白被氧化修饰,导致线粒体功能失调、细胞代谢紊乱,而后者又可加重ROS的生成,加剧氧化应激。氧化应激普遍存在于各种神经变性疾病中,也是AD的重要病理机制之一,然而目前临床上针对AD的抗氧化治疗并未产生令人满意的效果,对AD氧化应激机制的深入研究将有助于寻找新的治疗AD的靶点。由于线粒体内膜电子传递链可产生ROS,既往一直认为细胞内ROS的主要来源是线粒体,然而近年来越来越多的证据显示,NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)在细胞内ROS的产生中同样起重要作用。NOX是由细胞内-组具有氧化活性的蛋白组成的酶复合体,其主要的生物学功能是产生ROS,分布于几乎所有的器官、组织和细胞。NOX的亚基包括催化亚基gp91phox,调节亚基p22phox、p47phox,以及p67phox、p40phox、Rac等,其中gp91phox和p22phox存在于胞膜,其他亚基分布于胞浆。而gp91phox (NOX2)及其同源物NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2被称为NOX家族。NOX通过生成的ROS参与细胞生理活动的调控,包括细胞生长、分化、凋亡以及细胞骨架重塑等,但在异常状态下如缺血缺氧、机械损伤、毒性物质或炎性因子刺激等过度激活可产生大量ROS,可造成氧化应激损伤。NOX的激活需要各种亚基组装成有活性的复合体后才能发挥其生物学功能,而胞浆亚基向胞膜迁移并组装成复合体是NOX激活的基础,其中p47phox C末端的PRR区可以与p67phoxC末端的SH3区结合,从而发挥募集p67phox、p40phox和Rac的作用。研究显示NOX参与了AD的病理过程,尤其是NOX2。几种AD的动物模型研究显示阻断NOX2具有神经保护作用。在野生型小鼠大脑皮质,利用Aβ1-40新皮层灌流可导致ROS生成及脑血管调节紊乱,而Aβ1-40处理的NOX2/-小鼠未出现ROS升高。将表达APP Swedish突变(Tg2576,可导致Aβ片段聚集)的小鼠与Cybb-/-鼠(NOX2功能缺失)杂交,发现去除功能性NOX2可抵抗Ap斑块的毒性作用,明显降低氧化应激。研究发现在培养的神经元和小鼠海马中,基因沉默p47phox或利用二苯基碘(Diphenylene iodonium, DPI)阻断NOX2可抑制经NMDA受体诱导的超氧化物生成。以上研究表明NOX2参与了AD的病理过程,但对于在AD中起重要作用的胆碱能神经元中,在AD病理条件下NOX2亚基的表达变化尚未见报道。线粒体在能量代谢及电子链传递中可产生ROS,在病理条件下可出现代谢紊乱,大量ROS产生,导致氧化应激。脑内线粒体的含量是肝脏或心脏的七倍,诸多研究发现线粒体参与了AD的病理过程,在氧化应激损伤中起重要的作用。些基于血管内皮细胞的研究发现,作为细胞内ROS两个主要来源,线粒体与NOX之间可能存在相互作用,两者可能通过产生的ROS而相互激活,导致氧化应激加剧,细胞凋亡。然而在AD的病理条件下,神经元内线粒体与NOX2之间是否也存在相互作用,通过对线粒体进行干预是否可影响NOX2,目前尚未见报道。近年来不少研究表明线粒体ATP敏感性钾离子通道(Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, MitoKATP)可能是各种脑预适应的一个触发器和(或)效应器。无论是在体内还是体外,MitoKATP均参与预处理对脑的保护作用,且这种保护作用大多数可被MitoKATP拮抗剂5-羟葵酸(5-hydroxydecanoate,5-HD)所逆转。MitoKATP可被二氮嗪激活,可使线粒体膜发生去极化,抑制ROS的释放并维持线粒体结构的稳定,具有一定的细胞保护作用。二氮嗪可抵抗鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡,可通过稳定线粒体膜电位抑制过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元凋亡,具有抗氧化应激的作用。在AD的病理条件下,预激活胆碱能神经元MitoKATP是否可影响NOX2的表达,从而起到抗氧化应激的作用,目前尚未见报道。目的：本研究利用Aβ1-42作用原代培养的大鼠胆碱能神经元作为AD的病理模型,用二氮嗪作为MitoKATP通道激活剂,以DPI为NOX2的阻断剂,对以下问题进行探讨：1.观察Aβ1-42对原代培养胆碱能神经元内ROS和细胞活性的影响以及对NOX2主要亚基表达的影响,探讨Aβ1-42致氧化应激的机制。2.观察DPI对Aβ1-42作用原代培养胆碱能神经元内ROS生成以及细胞活性的影响,探讨NOX2是否参与Ap诱导的胆碱能神经元细胞内氧化应激。3.观察预激活MitoKATP对Aβ1-42作用原代培养胆碱能神经元内ROS和细胞活性的影响以及对NOX2主要亚基表达的影响,探讨在AD的病理条件下,神经元内线粒体与NOX2之间是否存在相互作用,通过预激活MitoKATP是否可影响神经元NOX2的表达,从而起到抗氧化应激的作用。方法：1.大鼠胆碱能神经元的培养和鉴定：无菌条件下取孕16-18d Wistar胎鼠大脑,解剖显微镜下剥取基底前脑组织,去除脑膜和血管等杂质,用0.125%的胰蛋白酶消化,以含10%胎牛血清及2%B27的高糖DMEM培养。胆碱能神经元鉴定采用胆碱乙酰化酶(Choline acetylase, ChAT)免疫细胞化学鉴定。2.试验分组：随机分为6个组：对照组、Aβ1-42处理组(2μM Aβ1-42处理24h或72h)、二氮嗪预处理+Ap1-42干预组(500μM二氮嗪预处理1h后加入Aβ1-42处理24h或72h)、DPI预处理+Ap1-42干预组(1 μM DPI预处理1h后加入Aβ1-42处理24h或72h)、DPI预处理组(1μM DPI预处理1h)、二氮嗪预处理组(500μM二氮嗪预处理1h)；各组又分为24h和72h两个亚组。3.细胞活性的检测：胆碱能神经元分组培养并药物处理后,使用MTT方法检测细胞活性的变化。4.细胞内ROS及MDA的检测：用氧化敏感的荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的水平,用脂质氧化MDA检测试剂盒检测细胞MDA水平的变化。5.NOX2亚基表达的检测：免疫荧光双染及免疫印迹观察干预不同时间后胆碱能神经元NOX2主要亚基gp91phox和p47phox蛋白表达水平的变化。结果：1.大鼠胆碱能神经元的培养和鉴定：ChAT是乙酰胆碱的合成酶,是突触前胆碱合成的标志酶,培养的神经元在第7天行ChAT免疫细胞化学染色,结果显示90%以上为胆碱能神经元。2.通过MTT检测胆碱能神经细胞活性,结果表明,与对照组相比,Ap1-42处理组细胞活性较对照组显著下降(24h亚组P<0.05,72h亚组P<0.001),而二氮嗪或DPI预处理+Aβ1-42干预组与对照组相比24h亚组无明显差异(P>0.05),72h亚组细胞活性明显下降(P<0.01),但较Aβ1-42处理组明显升高(P<0.01),提示具有抵抗Ap1-42神经毒性的作用。3.免疫荧光双染及免疫印迹结果显示,Ap1-42处理组与对照组相比,gp91phox及p47phox表达显著升高(24h亚组P<0.01,72h亚组P<0.001)；二氮嗪预处理+Aβ1-42干预组(24h亚组)与Aβ1-42处理组(24h亚组)比较gp91phox及p47phox显著下调(P<0.01),与对照组(24h亚组)比较无明显变化,表明二氮嗪预处理可逆转Aβ1-42诱导的NOX2表达上调；二氮嗪预处理+Aβ1-42干预组(72h亚组)与Aβ1-42处理组(72h亚组)比较gp91phox及p47phox显著下调(P<0.05),与对照组(72h亚组)比较差异也有统计学意义(P<0.05),表明二氮嗪仅能部分逆转这种表达上调,但仍有显著统计学差异。由于NOX2表达增加可导致细胞内ROS生成增加,这些结果表明二氮嗪可能通过降低NOX2的表达来抑制Aβ1-42诱导的ROS生成。4.为证实二氮嗪及DPI预处理可以抑制Aβ1-42导致的氧化应激,我们检测了Aβ1-42处理胆碱能神经元后ROS及MDA的水平。结果显示Aβ1-42处理组胆碱能神经元内ROS及MDA水平较对照组显著升高(24h亚组P<0.01,72h亚组P<0.001),而二氮嗪或DPI预处理+Aβ1-42干预组神经元ROS及MDA的水平较Aβ1-42处理组明显降低(24h亚组P<0.05,72h亚组P<0.01),表明二氮嗪或DPI均可抑制Aβ1-42诱导的ROS及MDA生成,减轻氧化应激。结论：1.Aβ1-42可导致胆碱能神经元NOX2主要亚基gp91phox和p47phox表达上调,从而导致细胞内ROS生成增加,引起氧化应激。2.DPI可抑制NOX2的活性,降低神经元内ROS的生成,从而抑制Ap1-42导致的胆碱能神经元氧化应激损伤,表明NOX2参与了Aβ诱导的胆碱能神经元细胞内氧化应激。3.通过二氮嗪预激活MitoKATP可抑制Aβ1-42诱导的胆碱能神经元NOX2的表达上调,减少细胞内ROS的生成,从而起到抗氧化应激的作用,表明在AD的病理条件下及时对线粒体进行干预可抑制NOX2介导的氧化应激。