肽酰精氨酸脱亚胺酶4（Peptidyl arginine deiminases type4,PAD4）是一种钙离子依赖蛋白,能够催化组蛋白瓜氨酸化。近年来多项研究表明组蛋白瓜氨酸化能够促进中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）以及肿瘤细胞外染色质网络（Cancer extracellular chromatin networks,CECN）的形成,从而促进炎症损伤、肿瘤转移等多种疾病发展。随着对PAD4与相关疾病关系的深入研究,发现PAD4蛋白在直肠癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等多种肿瘤组织中高表达,抑制内源PAD4表达或抑制其活性有利于治疗这些疾病。目前大量科研工作都围绕着PAD4蛋白功能以及它在疾病发展中的作用等方向展开,缺乏对于上游基因表达调控机制的研究。真核生物基因表达调控包括转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控等多个层面。对于基因转录水平调控的分析,关键点在于找出顺式调控元件序列如启动子、增强子和沉默子等,借助数据库对基因调控元件进行预测,结合双荧光素酶报告基因技术进行验证可分析启动子区域以及转录因子结合位点。基于CRISPR/Cas9基因编辑原理,张锋团队设计了CRISPR/Cas9 g RNA文库筛选技术,可用于基因组规模的功能基因筛选。根据已发表研究成果,可对CRISPR/Cas9文库中g RNA进行不同的靶向设计,例如,靶向基因编码区的g RNA文库主要用于筛选耐药基因,靶向基因非编码区的g RNA文库用于筛选具有特定功能的DNA序列,包括启动子和增强子等顺式调控元件。CRISPR/Cas9 g RNA文库技术作为一项强大的大规模分析技术,被越来越多的科学家运用在更多的研究方向以挖掘其潜在价值。本研究将对小鼠Padi4基因表达调控机制进行探索。第一部分主要实验内容是对小鼠Padi4基因上游顺式调控序列的分析,采用以下实验方法:（1）利用生物信息学分析工具对小鼠Padi4基因上游4 kb序列内可能包含的顺式调控元件和转录因子结合位点等进行预测;（2）利用同源重组技术构建不同长度顺式调控序列缺失和包含转录因子结合位点突变序列作为启动子的荧光素酶表达载体进行检测与分析;（3）通过荧光定量PCR实验分析过表达转录因子后对Padi4基因表达的影响。第二部分主要内容是利用靶向小鼠基因CDS区的CRISPR/Cas9 g RNA文库筛选能够影响PAD4表达的因子,采用以下实验方法:（1）通过慢病毒技术将g RNA文库导入4T1细胞;（2）通过流式分选技术、高通量测序技术和生物信息学分析技术实现候选基因筛选;（3）将候选基因g RNA导入4T1细胞进行验证。在本研究中,我们成功构建了小鼠Padi4基因上游-3867/+62区域内12个不同长度缺失的荧光素酶表达载体和包含-1464/+62区域内转录因子突变位点的表达载体。双荧光素酶实验结果显示:（1）小鼠Padi4基因-1464/+62为启动子区域,-125/+62为核心启动子区域;（2）TATA-box位置在-31/-25;（3）小鼠Padi4基因上游-1464/+62区域内有两个Sp1结合位点分别位于-154/-144、-946/-936。通过CRISPR/Cas9 g RNA文库和高通量测序技术成功筛选并验证影响Padi4表达的两个调控因子Ppp3ca和Calu,其中Ppp3ca起正向调控作用,Calu起负向调控作用。