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目的:1、观察催乳素刺激INS-1细胞口袋蛋白家族和相关E2F表达的变化。2、探究催乳素调控Rb表达,影响β细胞增殖的机制。3、观察胰腺特异性Rb基因敲除的小鼠妊娠期胰岛β细胞增殖及功能的变化。方法:1、体外培养INS-1细胞,予合适浓度的催乳素刺激,提取细胞RNA及蛋白,实时定量聚合酶链式反应(qPCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测口袋蛋白家族及E2F基因和蛋白表达的变化。采用免疫荧光和Western Blot技术观察INS-1细胞中Rb、磷酸化Rb(p-Rb)的核浆定位及催乳素刺激后的变化。2、在催乳素刺激的体系下,使用STAT5,AKT,JNK和ERK1/2抑制剂后,Western Blot技术检测Rb和p-Rb的变化;筛选出阳性通路后进一步观察在该抑制剂作用下相关蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化,qPCR检测细胞周期相关因子表达的变化。在催乳素刺激的体系下使用抑制剂抑制Rb磷酸化,检测Rb、p-Rb、E2F1及细胞周期的变化。通过脂质体转染小干扰RNA抑制Rb的表达后,加催乳素刺激,Western Blot技术观察Rb、E2F1表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化,qPCR技术检测细胞周期相关因子表达的变化。3、采用免疫组化法检测胰腺特异性Rb基因敲除小鼠及野生型对照组小鼠在NP、P18.5时胰岛β细胞量、β细胞数目及面积、胰岛数目及大小的变化,采用免疫荧光法检测两组小鼠在NP、P14.5时Ki67阳性的胰岛β细胞比例的变化。腹腔葡萄糖耐量试验检测各组小鼠糖耐量的差异。结果:1、1)qPCR结果显示,与对照组相比,催乳素刺激的INS-1细胞Rb、p107和E2f1-3表达均增加,p130和E2f4-5表达均降低,Rb的磷酸化水平增高。2)Western Blot及免疫荧光结果显示,在INS-1细胞中,Rb主要定位于胞核,p-Rb胞浆多于胞核;催乳素刺激促进Rb和p-Rb的表达,促进Rb的磷酸化。2、1)Western Blot结果显示,在催乳素刺激体系中使用各通路抑制剂后,只有STAT5通路被阻断时,INS-1细胞Rb和p-Rb的表达有显著性下降。2)催乳素作用下,INS-1细胞的Rb、p-Rb、CDK4、E2F1的表达显著升高,细胞增殖增加;在此体系中加入STAT5抑制剂,Rb、p-Rb、CDK4、E2F1的表达显著下降,增殖指数降低。3)在催乳素刺激下加CDK4/6抑制剂,p-Rb、E2F1的表达显著下降,细胞增殖指数降低。4)使用siRNA干扰INS-1细胞Rb表达后,E2F1表达上升,促进细胞周期进程;在此基础上进一步加催乳素刺激,E2F1表达及细胞周期无明显变化。3、1)与野生型相比,NP时,胰腺Rb基因敲除小鼠β细胞量增加、细胞数目明显增加;P18.5时野生型小鼠β细胞量、数目、面积均显著增加;而胰腺Rb基因敲除小鼠β细胞量、细胞数目较NP时未见进一步显著增加。2)NP时,胰腺Rb基因敲除小鼠Ki67阳性的β细胞比例较野生对照组有明显的上升;在P14.5时,野生型孕鼠与NP相比Ki67阳性细胞明显增加,而敲除组P14.5与NP相比Ki67阳性细胞比例增加不明显。3)NP时,胰腺Rb基因敲除的小鼠相比野生型小鼠腹腔糖耐量更好;P14.5天时,胰腺Rb基因敲除组小鼠腹腔糖耐量仍优于野生型孕鼠。结论:1、催乳素引起INS-1细胞Rb、p107和E2F1-3的表达上调,p130和E2F4-5表达下调,Rb的磷酸化增多,促进细胞增殖。2、STAT5信号通路介导催乳素刺激的Rb-E2F表达调控,促进Rb和p-Rb表达。催乳素通过STAT5/Cyclin/CDK途径促进Rb磷酸化是引起细胞增殖的关键。3、Rb缺失促进β细胞增殖,改善小鼠糖耐量,妊娠期β细胞的扩增与Rb相关。