硫酸软骨素的降解及其产物的抗氧化活性研究

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硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一类广泛存在于动物结缔组织中的硫酸化线性粘多糖。研究表明硫酸软骨素具有抗氧化、抗凝血、降血脂、抗关节炎及免疫调节等多种生物活性。目前,国内外对硫酸软骨素的研究主要集中在提取、含量测定及生物活性等方面,而对低分子量硫酸软骨素的相关研究较少。低分子量硫酸软骨素更利于被机体吸收,在生物医药等方面具有潜在的应用价值,因此对低分子量硫酸软骨素的研究具有重要意义。基于此,本文以牛鼻软骨为原料提取硫酸软骨素并对其进行分离纯化,采用氧化降解法对纯化后组分进行降解,对降解前后的不同组分进行理化性质及抗氧化活性比较研究,为不同分子量硫酸软骨素的开发应用提供科学依据。主要研究结果如下:1.硫酸软骨素的提取及分离纯化采用复合酶法提取硫酸软骨素CS,经DEAE-cellulose分离纯化后得到三个组分CS-Ⅰ、CS-Ⅱ、CS-ⅡI,其中CS-Ⅱ得率最高,占总得率的54%。对其进行理化性质测定,经单糖组成测定发现CS及纯化组分均由GlcUA、GalN与Gal组成,分子量测定表明标准品、CS及CS-Ⅰ、CS-Ⅱ、CS-ⅡI的分子量分别为115.5 kDa、116.3 kDa、88.3 kDa、129.4 kDa、273.8 kDa;硫酸基含量分别为23.42±0.41%、20.21±0.37%、2.10±0.53%、16.76±0.69%、21.14±0.56%;糖醛酸含量分别为41.31±0.83%、30.40±0.90%、8.43±0.71%、31.32±0.51%、29.81±0.78%。以上结果表明,CS-Ⅰ的糖醛酸含量及硫酸基含量最低且分子量远小于标准品,CS-ⅡI的硫酸基含量高但其分子量远大于标准品,CS-Ⅱ的糖醛酸含量最高,硫酸基含量及分子量均与标准品相近且得率最高,故选取CS-Ⅱ进行降解以及后期活性研究。2.CS-Ⅱ的降解条件的筛选采用H2O2-Vc氧化降解体系对分离纯化所得CS-Ⅱ组分进行降解,通过改变H2O2和Vc的浓度获取不同分子量段组分,结果表明Vc浓度能够显著影响CS-Ⅱ分子量的变化。通过筛选,选取降解后的四个组分CS-Ⅱ-1:92.7 kDa、CS-Ⅱ-2:54.1 kDa、CS-Ⅱ-3:26.3 kDa、CS-Ⅱ-4:19.7 kDa进行红外光谱分析及理化性质测定。红外光谱分析结果表明降解前后组分均具有硫酸软骨素特征吸收峰,说明此氧化降解体系未对CS-Ⅱ的主要结构造成破坏。理化性质结果显示降解前后硫酸基含量无明显差异,分别为16.70±0.26%、16.45±0.21%、16.59±0.56%、16.40±0.42%、16.75±0.77%;与CS-Ⅱ(糖醛酸含量为31.32±0.51%)相比,降解后组分糖醛酸含量升高,分别为41.51±0.63%、37.24±0.98%、35.65±0.95%、36.18±0.72%;单糖组成测定表明降解前后各组分均由GlcUA、GalN与Gal组成,但降解后各组分的GlcUA相对摩尔比增加,与比色法结果相符。为进一步探索不同分子量段组分的生物活性差异,后期选取CS-Ⅱ及降解组分进行抗氧化活性研究。3.CS-Ⅱ及其降解产物的抗氧化活性比较通过对CS-Ⅱ及其降解产物的超氧阴离子(.O2-)、羟基自由基(.OH)、DPPH自由基及还原能力进行测定,结果表明CS-Ⅱ及其降解组分均具有一定的抗氧化活性且呈浓度依赖性。此外,四个降解组分的抗氧化活性均高于CS-Ⅱ,其中分子量最小的组分CS-Ⅱ-4的抗氧化活性最强,其DPPH自由基清除力高达74.78%。
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