【摘 要】
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目的:探讨茶多酚在脂多糖介导的甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的炎症中的影响及其作用机制,为甲状腺相关眼病的治疗提供新的思路。方法:甲状腺相关眼病组:纳入因压迫性视神经病变行眼眶减压术的甲状腺相关眼病患者（n=6）,术中取球后眼眶结缔组织标本。对照组:选取与实验组年龄、性别相匹配的因陈旧性眼外伤或非炎症性角巩膜葡萄肿行眼球摘除的患者（n=4）,术中取球后眼眶结缔组织标本。纳入患者均无活动性炎症。选取眼
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目的:探讨茶多酚在脂多糖介导的甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的炎症中的影响及其作用机制,为甲状腺相关眼病的治疗提供新的思路。方法:甲状腺相关眼病组:纳入因压迫性视神经病变行眼眶减压术的甲状腺相关眼病患者（n=6）,术中取球后眼眶结缔组织标本。对照组:选取与实验组年龄、性别相匹配的因陈旧性眼外伤或非炎症性角巩膜葡萄肿行眼球摘除的患者（n=4）,术中取球后眼眶结缔组织标本。纳入患者均无活动性炎症。选取眼眶球后组织用于眼眶成纤维细胞的原代培养来源。用免疫组织化学法确定我们所提取的原代细胞为眼眶成纤维细胞。用RT-q PCR检测甲状腺相关眼病组和对照组眼眶成纤维细胞的炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1的表达。用CCK-8法检测不同浓度茶多酚对眼眶成纤维细胞增殖活力的影响。以1:3的比例传代,分别将等量的细胞种植于培养皿中,待细胞贴壁后将眼眶成纤维细胞分为三组:甲状腺相关眼病组,甲状腺相关眼病+脂多糖（浓度为10μg/m L）组,甲状腺相关眼病+脂多糖+茶多酚（浓度为100μmol/L）组;低血清干预24h后,用RT-q PCR和ELISA检测各组炎症因子的表达。进一步,我们用Western blot检测了各组间NF-κB和NLRP3的表达,用免疫荧光法检测NLRP3的表达。结果:我们从眼眶组织中培养出了眼眶成纤维细胞的原代细胞,并对其生长规律、细胞形态进行了观察。免疫组织化学法鉴定结果显示,Vimentin表达为阳性,说明所提取的细胞为间充质来源;Desmin、Myoglobin、Keratin17和S100B表达为阴性,排除混杂其他来源细胞的可能性,即确定所提细胞为眼眶成纤维细胞。RT-q PCR结果显示,甲状腺相关眼病患者来源的眼眶成纤维细胞中IL-1βm RNA的表达量是对照组的50倍（P<0.05）,IL-6m RNA的表达量是对照组的4.7倍（P<0.05）,MCP-1 m RNA的表达量是对照组的18倍（P<0.05）。我们用不同浓度的茶多酚干预眼眶成纤维细胞,CCK-8检测各浓度下眼眶成纤维细胞的吸光度,并计算各浓度下细胞的存活率。结果显示,当茶多酚浓度在100μmol/L以上时,细胞活力降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。这表明,在一定程度内,茶多酚的浓度越高,甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的细胞活力越低,我们将茶多酚的干预浓度设定为100μmol/L。在脂多糖刺激下,眼眶成纤维细胞的炎症水平显著增加:甲状腺相关眼病+脂多糖组中IL-1β的m RNA表达约为甲状腺相关眼病组的3倍（P<0.001）,IL-6的m RNA表达约为甲状腺相关眼病组的10倍（P<0.001）,MCP-1的m RNA表达约为甲状腺相关眼病组的4倍（P<0.001）;茶多酚干预可以显著降低眼眶成纤维细胞中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达（P<0.001）。取干预后的细胞培养基上清,ELISA结果与RT-q PCR结果呈现出一致的变化趋势:脂多糖刺激可以诱导眼眶成纤维细胞IL-1β、IL-6及MCP-1的表达显著增加,且差异均有统计学意义。使用茶多酚处理可有效抑制脂多糖诱导的细胞炎症反应,减少IL-1β、IL-6及MCP-1的过表达,差异均有统计学意义。为了探究茶多酚对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞中炎症因子影响的机制,我们用Western blot检测了NLRP3和NF-κB的蛋白表达,用免疫荧光法检测了NLRP3的表达情况。Western blot检测发现NF-κB、NLRP3的表达与炎症因子的表达呈现相同的趋势,即甲状腺相关眼病+脂多糖组中NF-κB、NLRP3的表达比甲状腺相关眼病组增多;加入茶多酚干预的眼眶成纤维细胞中,NF-κB、NLRP3的表达减少。除此之外,NLRP3的免疫荧光结果与蛋白免疫印迹结果一致。结论:甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞中炎症因子表达比对照组眼眶成纤维细胞高;脂多糖刺激可以诱导甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞发生炎症反应;茶多酚可通过NF-κB/NLRP3信号通路减弱脂多糖刺激引起的甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的炎症反应;茶多酚对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的保护机制或可为甲状腺相关眼病的治疗提供新的思路或者新的辅助治疗方式。
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