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【背景与目的】葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）又被称为免疫球蛋白重链结合蛋白（Binding immunoglobulin protein,BIP）或热休克蛋白A5（Heat shock protein A5,HSPA5）,是热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）家族成员。GRP78组成性表达在内质网中,作为伴侣蛋白辅助蛋白质的正确折叠。当内质网处于应激状态,如缺氧、感染等情况时,GRP78的表达上调,辅助内质网中的蛋白质正确折叠,避免错误折叠和变性的蛋白质在胞内的蓄积,以缓解内质网的应激状态,同时阻止细胞的凋亡。上调的GRP78可以转移至细胞的其他部位,也可分泌到细胞外成为分泌型GRP78（secreted GRP78,sGRP78）。研究表明,分泌到胞外的GRP78在炎症反应中具有免疫调节功能,是一种炎症消退相关分子模式（RAMPs）。实验室前期研究发现,sGRP78能诱导BMDCs成为耐受型DC细胞、诱导脾脏CD19+B细胞成为CD19hiPD-L1+/FasL+高分泌IL-10的B细胞,并且能够通过CD14/TLR4信号通路抑制LPS诱导BMDCs分泌炎性细胞因子等。溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）的发生发展与结肠组织局部的免疫细胞功能的紊乱有非常紧密的联系。在溃疡性结肠炎的发生发展过程中,结肠细胞内的GRP78是否能从细胞内转移至细胞外,以及转移至胞外的sGRP78功能则鲜有研究。本硕士学位课题在课题组前期研究基础上,通过对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型腹腔给予sGRP78,旨在探讨sGRP78对于DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响及其机制。【方法】1.小鼠sGRP78的表达和纯化将课题组前期构建的含全长小鼠sGRP78基因质粒BL21感受态细菌复苏后,经过氨苄青霉素抗性LB培养基扩大培养、IPTG诱导表达、超声裂菌和超速离心后得到细菌蛋白;细菌蛋白经GST纯化柱纯化,凝血酶作用后收集sGRP78流出液体,并去除内毒素,BCA法测定蛋白浓度,超净台内滤菌后分装,-80℃保存;并预留部分样品供SDS-PAGE和western blot鉴定。2.DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型的建立制备浓度为2.5%的DSS溶液;选用周龄为8周、体重为18-20 g的C57BL/6J品系的小鼠,随机分为三组,即未处理组（Normal）、对照组（DSS+NS）和实验组（DSS+sGRP78（10μg/g））;模型开始时,给予2.5%DSS水,每两天更换一次,持续五天后全部更换为正常无菌ddH2O,直到第八天处死小鼠。监测小鼠的症状;HE染色评估结肠组织病理学改变;CBA法检测小鼠结肠局部和血液中IL-6、TNF-α及IFN-γ等炎性细胞因子的表达;ELISA法测小鼠血清中IL-10的浓度;流式细胞术检测结肠组织固有层中浸润的淋巴细胞,肠系膜淋巴结、脾脏和腹腔中巨噬细胞的比例、表型的变化,肠系膜淋巴结和脾脏中Tregs比例的变化;western blot检测结肠组织中TLR4/NF-κB、TLR4/MAPKs及TRIF/IRF3信号通路的活化,iNOS、COX2等关键酶的表达,以及肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin的表达。3.sGRP78对LPS刺激小鼠BMDMs和腹腔巨噬细胞影响的检测将小鼠BMDMs分成3组:未处理组（1640）、LPS处理组（100 ng/ml）和sGRP78处理组（10μg/ml）。4小时后,提取细胞mRNA,qRT-PCR检测IL-6、TNF-α、iNOS、Ym1、MGL1和Fizz1等基因的表达;24 h后收细胞培养上清,利用CBA法测上清中IL-6、TNF-α及IFN-γ等细胞因子的表达。在巨噬细胞极化逆转实验中,将BMDMs消化后铺板,除未处理组外,其余组均用LPS（100 ng/ml）刺激18 h,分为未处理组（1640+1640）、LPS处理组（100 ng/ml LPS+100 ng/ml LPS）、sGRP78处理组（100 ng/ml LPS+10μg/ml sGRP78）和IL-4处理组（100 ng/ml LPS+20 ng/ml IL-4）;分别培养12 h和24 h后收细胞培养上清,利用CBA法测上清中IL-6、TNF-α及IFN-γ等细胞因子的表达;用qRT-PCR的方法检测IL-6、TNF-α及iNOS等基因的表达。将小鼠腹腔巨噬细胞分为5组,分别为未处理组（1640）、LPS组（100ng/ml）、LPS（100 ng/ml）+sGRP78组（10μg/ml）、sGRP78组（10μg/ml）和IL-4组（20 ng/ml）,24 h后用qRT-PCR法检测腹腔巨噬细胞的IL-6、TNF-α及iNOS等mRNA表达。4.LPS/sGRP78对小鼠原代结肠上皮细胞影响的检测分离获取小鼠结肠上皮细胞,高浓度LPS（10μg/ml）处理肠上皮细胞,同时sGRP78浓度梯度干预,1 h后提取细胞总蛋白,western blot检测TLR4/NF-κB、TLR4/MAPKs和TRIF/IRF3等相关信号通路中p65、p38、ERK、JNK、IRF3等的磷酸化水平;4 h后,qRT-PCR检测IL-6、TNF-α等基因mRNA表达;24 h后用CBA法检测细胞培养上清中IL-6、TNF-α及IFN-γ等细胞因子的表达;同时提取IECs总蛋白,western blot检测TLR4、iNOS及COX2等的表达。【结果】1.sGRP78能缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（1）监测DSS造模小鼠的症状、病理改变、炎症细胞浸润及炎性因子的释放等,发现与未处理组相比,DSS诱导的小鼠出现体重下降、稀便、血便,结肠明显缩短,甚至死亡;HE染色显示结肠末端病理学评分显著增高;结肠末端组织体外培养上清和小鼠血清中的细胞因子,如IL-6、TNF-α以及IFN-γ的表达都有明显的升高。腹腔注射sGRP78后观察到相关症状显著缓解,组织学评分以及炎性细胞因子的表达都有显著下降;（2）DSS小鼠结肠固有层内CD45+白细胞百分比升高;小鼠腹腔、肠系膜淋巴结以及脾脏中的巨噬细胞被活化,CD80、CD86表达增加。腹腔注射sGRP78后,结肠组织局部的CD45+白细胞比例显著下降,小鼠腹腔巨噬细胞比例显著下降,CD80表达下调,脾脏中巨噬细胞CD80、CD86表达下调,且脾脏和肠系膜淋巴结中巨噬细胞CD206表达增加;（3）DSS小鼠肠系膜淋巴结以及脾脏中Tregs比例相较于正常对照组并没有显著变化。腹腔注射sGRP78后,肠系膜淋巴结和脾脏中的Tregs的比例有显著的上升;（4）western blot结果表明,DSS造模小鼠末端结肠TLR4/NF-κB、TRIF/IRF3及TLR4/MAPKs信号通路被激活,例如p-p65、p-IRF3、p-P38、p-ERK及p-JNK等表达增加;结肠组织中TLR4、COX2及iNOS表达也显著增加。腹腔注射sGRP78后,结肠组织p-p65、p-IRF3、p-P38、p-ERK及p-JNK等表达显著下调,结肠组织TLR4、COX2及iNOS表达也显著下调。2.sGRP78体外抑制LPS诱导小鼠BMDMs和腹腔巨噬细胞向M1极化（1）与未处理组相比,LPS能够诱导BMDMs分泌大量IL-6、TNF-α以及IFN-γ等炎性细胞因子,并使iNOS的mRNA水平明显高表达;sGRP78能显著抑制上述炎性细胞因子的表达和分泌;（2）巨噬细胞极化逆转实验结果显示,LPS能够诱导BMDMs向M1型巨噬细胞极化,而IL-4能够明显逆转LPS对于BMDMs向M1型巨噬细胞极化作用,sGRP78能部分逆转LPS对BMDMs向M1极化的促进作用;（3）sGRP78对于腹腔巨噬细胞的影响与BMDMs类似,即LPS能够诱导腹腔巨噬细胞的IL-6、TNF-α以及iNOS的mRNA水平的显著升高,而sGRP78对上述分子的表达无明显影响。3.sGRP78对LPS诱导小鼠原代肠上皮细胞的作用（1）与未处理组相比,LPS能够诱导IECs分泌大量的IL-6、TNF-α以及IFN-γ等细胞因子,sGRP78能够显著抑制LPS引起的上述细胞因子的分泌;（2）免疫印迹实验结果显示,LPS能够诱导小鼠原代肠上皮细胞TLR4/NF-κB、TRIF/IRF3以及TLR4/MAPKs信号通路的激活,而sGRP78能呈剂量依赖性地下调这些信号通路分子的激活,并下调COX2及iNOS的表达。【结论】本学位课题研究发现sGRP78能缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎,这种缓解作用可能是通过抑制巨噬细胞及肠上皮细胞过度活化,以及TLR4相关信号通路而介导:（1）sGRP78能够缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎,抑制结肠组织中TLR4/NF-κB、TRIF/IRF3及TLR4/MAPKs信号通路的激活,下调炎性蛋白酶及炎性细胞因子的表达;（2）巨噬细胞在sGRP78消退炎症的过程中可能发挥了重要作用;（3）在体外实验中,sGRP78能够部分逆转LPS促进巨噬细胞向M1极化;通过抑制TLR4/NF-κB、TLR4/MAPKs及TRIF/IRF3通路的激活,抑制LPS对肠上皮细胞的炎症刺激作用。