论文部分内容阅读
研究背景及目的糖尿病视网膜病变（DR）作为糖尿病的严重并发症之一，造成严重的视力损害已引起广泛关注。本研究通过体外选择性培养牛视网膜血管内皮细胞(BREC)，探讨高糖环境对其的影响，并观察3-氨基苯甲酰胺（3-AB）对体外培养的高糖条件下的BREC生长及细胞增殖的影响，为糖尿病视网膜病变的治疗提供理论依据及治疗线索。方法①体外分离牛视网膜组织，结合选择性培养基的使用等方法选择性培养牛视网膜血管内皮细胞，Von Willebrand因子免疫组化鉴定，观察其形态学特点并制作生长曲线。②将传代后的细胞设为不同浓度梯度的葡萄糖和甘露醇对照组，以及空白对照组。四唑盐比色法描绘各干预组及对照组BREC的生长情况，流式细胞仪观察各种不同葡萄糖浓度对BREC影响。③分为低糖对照组、高糖对照组（30mmol/L）、高糖（30mmol/L）+不同浓度3-AB组（0.05mmol/L，0.1mmol/L，0.25mmol/L，0.5mmol/L，0.75mmol/L，1mmol/L），用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测BREC的增殖。采用流式细胞分析技术观察不同浓度3-AB对高糖环境中培养的BREC的凋亡的影响。结果①选择性培养的BREC能够连续传代，且纯度达到98%以上，对VonWillebrand因子抗体染色阳性，BREC融合后呈铺路石样单层生长，有接触抑制。其生长曲线显示该细胞在传代后的第3～4d进入对数期增殖，到第10～12d进入平台期。②葡萄糖浓度在10mmol/L到25mmol/L之间时，四唑盐比色实验显示对细胞增殖有促进作用；葡萄糖浓度>30mmol/L时，四唑盐比色实验显示抑制细胞增殖，同时，流式细胞分析在细胞周期的凋亡峰增加。③MTT比色法显示，一定浓度的3-AB可以降低高糖对BREC生长的抑制作用。在浓度为0.25mmol/L时OD值差异有统计学意义（P<0.01）。流式细胞分析技术显示，0.25mmol/L的3-AB可明显减少BREC的凋亡。结论①选择性培养方法的应用可获得较高纯度的BREC，简单且重复性好，无需额外除杂步骤。②葡萄糖在一定浓度时促进牛视网膜血管内皮细胞增殖，在一定的高浓度时抑制其增殖。③一定浓度的3-AB对体外高糖环境中培养的牛视网膜毛细血管内皮细胞具有保护作用，其机制可能在于3-AB可以减少细胞凋亡。